2024年5月，沈陽藥科大學在國際學術期刊cell death & differentiation 發表一項重要研究成果，題為：PD-L2 drives resistance to EGFR-TKIs: dynamic changes of the tumor immune environment and targeted therapy。使用單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)、TUNEL、酶聯免疫吸附、流式細胞術、WB、CETSA、CCK-8來剖析腫瘤的耐藥機制。

期刊名稱：cell death & differentiation.

影響因子：13.7

合作單位：沈陽藥科大學

研究部位：小鼠異種移植腫瘤

研究方法：scRNA-seq、TUNEL、酶聯免疫吸附、流式細胞術、WB、HTRF、CCK-8

百邁客生物為該研究提供了單細胞測序技術服務。

研究背景

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-TKI） 是癌癥靶向治療的經典例子。已獲批的 EGFR-TKIs 單獨使用或與化療聯合用于治療非小細胞肺癌 （NSCLC）、結直腸癌 （CRC）、乳腺癌 （BC） 等。然而，大多數患者在 1-2 年后對 EGFR-TKI 產生獲得性耐藥，隨后癌癥復發和轉移。為了解決這一緊迫的臨床問題，迫切需要延遲和克服 EGFR-TKIs 耐藥的策略。到目前為止，獲得性 EGFR 突變、MET 擴增、ERBB2 擴增和旁路激活等作為 EGFR-TKI 耐藥的機制已得到充分研究。近年來，一些研究人員開始關注腫瘤免疫環境狀態與 EGFR-TKIs 治療療效之間的關系。臨床研究最近發現，EGFR-TKIs 治療可以重塑腫瘤免疫環境，但 EGFR-TKIs 與瘤周免疫細胞之間的關系尚未得到充分研究。

實驗材料

使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應，揭示腫瘤耐藥機制。

1、scRNA-seq

收集兩只小鼠的腫瘤樣本，共獲得 12,941 個細胞進行 scRNA-Seq。

2、HTRF

進行天然小分子化合物庫 （MCE） 的篩選，制作了 266 個樣品。篩選 PD-1/PD-L2 結合抑制劑。

研究結果

• 腫瘤免疫環境參與腫瘤對 EGFR-TKIs 的耐藥性

首先，該研究使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應。EGFR 突變或擴增存在于多種癌癥中，如非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌等。EGFR-TKIs 可以靶向 EGFR 敏感突變。因此，作者使用小鼠肺腺癌細胞 （LLC） 和結直腸癌細胞 （CT26） 作為工具細胞。作者用突變形式的人 EGFR 轉染小鼠細胞系 （LLC 和 CT26），攜帶外顯子 19 缺失 （EGFR19del） 或外顯子 21 L858R 錯義突變 （EGFRL858R），這會增加 EGFR 活性，以接近細胞模型到人類疾病，建立同基因荷瘤小鼠模型。在轉染 EGFR 突變體的細胞中，p-EGFR 和 p-ERK1/2 的表達增強，增殖速率顯著增加，表明細胞 EGFR 下游信號通路激活（圖 1A、B）。正如預期的那樣，EGFR 突變細胞對不同代 EGFR-TKI 更敏感，包括厄洛替尼、阿法替尼和奧希替尼（圖 1B）。為了全面探討 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者使用 EGFR 突變細胞建立了第一代和第三代 EGFR-TKIs 耐藥同基因小鼠模型（圖1C）。如圖1 D所示，第一代 （P1） LLC-EGFR19del 來源的腫瘤對奧希替尼敏感 （抑制率 = 44.0%）。在第 2 代 （P2） 中，作者將奧希替尼的劑量增加了一倍，腫瘤抑制率降低了一半 （22.2%）。用奧希替尼治療的第三代 （P3） LLC-EGFR19del衍生腫瘤被認為對奧希替尼耐藥，因為它們的體積與用生理鹽水治療的小鼠的體積沒有顯著差異。同時，作者還使用類似的方法成功獲得了對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFRL858R衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26-EGFR19del衍生腫瘤（圖 1D）。

為了進一步研究 EGFR-TKIs 耐藥與腫瘤免疫微環境之間的關系，作者將 P3 CT26-EGFR19del衍生的腫瘤接種到免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和嚴重免疫缺陷的 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中，然后作者評估了它們對厄洛替尼的反應性（圖 1E）。作者的結果表明，接種到 BALB/c 小鼠中的腫瘤對厄洛替尼治療保持耐藥性（抑制率 = 6.9%），而接種到 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中的腫瘤顯示出降低的耐藥性（抑制率 = 40.2%）（圖1E）。與體內腫瘤生長數據一致，增殖生物標志物 Ki67 的表達在用厄洛替尼處理后也顯示免疫缺陷異種移植腫瘤組織顯著減少，但在免疫活性異種移植腫瘤組織中沒有減少（圖 1F）。總之，這些結果表明腫瘤免疫環境參與 EGFR 突變腫瘤對 EGFR-TKI 的耐藥性。

• 腫瘤免疫環境由激活到抑制的動態變化驅動 EGFR-TKIs 耐藥

為了了解腫瘤免疫環境如何參與對 EGFR-TKI 的耐藥性，作者分析了治療過程中不同階段的腫瘤免疫環境特征（圖 2A）。作者測定了初始 EGFR-TKIs 治療時和耐藥發展期間 （P1-P3） 腫瘤免疫環境中腫瘤浸潤白細胞 （TIL） 的密度，其中用鹽水處理的腫瘤細胞作為 CTRL 組，用厄洛替尼或奧希替尼治療的腫瘤細胞作為 TKI 組。流式細胞術分析的免疫分析顯示，在治療早期，攜帶 EGFR19del?的腫瘤的 EGFR-TKIs 治療誘導腫瘤浸潤白細胞比例增加（圖2B）。然而，當荷瘤小鼠對 EGFR-TKI 產生耐藥性時，與 CTRL 組相比，腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低（圖2B）。這表明荷瘤小鼠對 EGFR-TKIs 的反應性改變伴隨著腫瘤免疫環境的動態變化。

為了準確反映腫瘤免疫環境的真實狀態，作者檢查了藥物治療期間荷瘤小鼠腫瘤免疫環境中的 T 細胞浸潤和功能。作者觀察到，兩種模型的 P1 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞比例均顯著增加，但隨著 TKI 治療的繼續，這種增加消失。TKI 耐藥 P3 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞的比例顯著降低（圖2C）。因此，作者假設 T 淋巴細胞，尤其是 CD8+?T 細胞，從最初的激活開始逐漸獲得功能失調的表型。為了檢驗這一假設，作者檢查了效應細胞因子在 T 細胞 （IFN-γ、IL-2、顆粒酶 B 和 TNF-α）中的表達。EGFR-TKIs 的初始治療刺激效應細胞因子的產生，但在耐藥發展的后期，效應細胞因子的水平似乎降低，并且與 CTRL 相比，IFN-γ 和顆粒酶 B 的產生顯著減少（圖2D， E）。這些結果表明 EGFR-TKIs 顯著影響腫瘤免疫環境。初始治療會引發有效的抗腫瘤免疫反應，從而顯著減少腫瘤生長。隨著時間的推移，EGFR-TKI 無法顯著控制腫瘤生長，并伴有 T 細胞浸潤和細胞因子產生的顯著減少。綜上所述，這些結果表明，隨著 EGFR-TKIs 治療時間的延長，腫瘤細胞由藥物敏感變為耐藥，免疫反應首先增強后抑制。

• 對 EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達的上調

為了探索腫瘤免疫環境變化的原因，作者同時檢測了不同傳代階段腫瘤組織中刺激性和抑制性免疫調節分子的表達。在 EGFR-TKI 的初始治療中，一些抑制性免疫檢查點的相對表達降低（圖隨著耐藥性的出現，抑制性免疫檢查點基因 PD-L1 和 PD-L2 的相對表達水平逐漸升高，尤其是 PD-L2 （圖3A）。為了進一步驗證 PD-L2 在 EGFR-TKI 耐藥腫瘤細胞中表達的增加，作者通過流式細胞術鑒定了 PD-L2 在 P3 腫瘤細胞厄洛替尼或奧希替尼處理的腫瘤細胞（耐藥，TKI 組）表面的表達，以生理鹽水處理的細胞為對照（敏感，CTRL 組）。作者的結果表明，與對照組織相比，腫瘤細胞表面 PD-L2 的表達在耐藥腫瘤組織中表現出顯著增加（圖3B）。接下來，為了進一步驗證，作者分析了先前構建的 EGFR 突變的 TKI 耐藥 NSCLC 細胞系 HCC4006R、HCC827R、PC9R 及其配對親本細胞中免疫檢查點標志物的表達水平。在三種耐藥細胞系中，PD-L2 的 mRNA 和蛋白表達水平顯著上調，而 PD-L1 的表達表現出不一致的變化（圖3C、D）。

為了探索這種現象的臨床價值，作者分析了臨床數據庫。使用 GEO 數據集，作者分析了 8 例 EGFR TKIs 治療前后切除的臨床患者肺癌組織中 PDCD1LG2?（編碼 PD-L2） 和其他免疫檢查點基因的變化。與作者的結果類似，作者觀察到 EGFR TKI 治療后患者組織中 PDCD1LG2?表達增加，但其他免疫檢查點相關基因沒有增加（圖3E）。此外，作者認為其他因素，例如 MET 擴增，可能涉及 EGFR-TKI 耐藥。作者利用 TCGA 數據集研究了 EGFR-TKIs 耐藥驅動基因的表達與人 CD274?（編碼 PD-L1） 或 PDCD1LG2?表達之間的關系。計算各驅動基因表達水平與 CD274?或 PDCD1LG2?表達水平之間的相關系數。結果表明，PD-L2 表達而不是 PD-L1 表達與 EGFR-TKIs 耐藥驅動基因的表達呈顯著正相關（圖 3F）。與體外實驗中的 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達的 PC9 細胞對上述耐藥驅動基因相關的抑制劑的抵抗力增強（圖3F）。這些結果與一些研究表明 EGFR-TKIs 耐藥機制與 PD-L1 表達有關的研究形成鮮明對比。總而言之，作者的結果提供了初步證據，表明 PD-L2 而不是 PD-L1 可能是介導 EGFR-TKIs 治療過程中腫瘤環境免疫抑制作用和驅動耐藥的關鍵分子。

• PD-L2 通過影響腫瘤免疫環境在介導 EGFR-TKIs 耐藥中發揮關鍵作用

為了研究 PD-L2 表達在免疫系統中的獨特作用和對 EGFR-TKI 的反應，作者在 CT26-EGFR19del?細胞系中過表達 PD-L1 和 PD-L2，并建立了 BALB/c 同基因小鼠模型（圖 4A）。使用攜帶空載體的 CT26-EGFR19del細胞系作為對照。作者通過測量腫瘤體積評估空載體組、PD-L1 過表達組和 PD-L2 過表達組小鼠腫瘤對厄洛替尼治療的敏感性。結果顯示，與空載體組相比，PD-L2 過表達組小鼠對厄洛替尼的腫瘤耐藥性顯著增加，但 PD-L1 過表達組對厄洛替尼的腫瘤耐藥性沒有增加（圖4B，C）。這些結果表明，PD-L2 的過表達會增加腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的耐藥性。為了進一步證實作者的發現，作者檢查了 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 EGFR-TKIs 治療荷瘤小鼠腫瘤免疫環境中 T 細胞浸潤和細胞因子產生的影響。結果顯示，CD4+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的比例在 3 組間差異不顯著。值得注意的是，與空載體組相比，PD-L2 過表達組的 CD8+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的百分比以及細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 的表達顯著降低（圖 4D）。然而，PD-L1 過表達組中的細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 沒有顯著變化（圖 4D）。免疫組化染色顯示，與空載體和 PD-L1 過表達組相比，PD-L2 過表達組腫瘤細胞增殖顯著增加（圖4E）。以上結果進一步表明，PD-L2 在厄洛替尼治療期間在抑制免疫反應、抑制細胞毒性 T 細胞浸潤和減少小鼠效應細胞因子產生方面起主導作用。因此，作者得出結論，在 EGFR-TKIs 治療過程中，PD-L2 水平升高通過介導腫瘤細胞的免疫逃逸來抑制腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的治療反應。

鑒于 PD-L2 在體內調節 T 細胞活性中的關鍵作用，作者通過體內實驗表明，PD-L2 的穩定沉默增加了 EGFR-TKI 的敏感性（圖4F，G）。為了進一步研究 PD-L2 如何影響對 EGFR-TKI 的耐藥動力學，作者在 EGFR-TKI 耐藥同基因小鼠模型的開發中穩定地沉默了 CT26-EGFRmut 細胞系中的 PD-L2（圖4H）。結果顯示，厄洛替尼在第一代顯著抑制 CT26-EGFR19del?衍生腫瘤的生長。重要的是，PD-L2 沉默導致對 EGFR-TKI 治療的耐藥性延遲發生。即使在第三代 （P3） 時對照組 （CT26-EGFR19del?shNC 衍生腫瘤） 出現耐藥性 （腫瘤抑制率 = 13.5%），PD-L2 沉默的腫瘤對 EGFR-TKIs 保持高敏感性 （腫瘤抑制率 = 52.7%） （圖4I，J）。綜上所述，作者的基因操作實驗表明，PD-L2 通過影響腫瘤免疫微環境在介導 EGFR-TKIs 耐藥中發揮關鍵作用。

• 阻斷 PD-L2/PD-1 聯合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細胞或腫瘤的生長

接下來，作者想進一步探討阻斷 EGFR-TKI 耐藥細胞中的 PD-L2/PD-1 是否可以通過增強免疫反應來增強腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水 （CTRL）、奧希替尼 （Os）、抗 PD-1 （αPD-1） 和奧希替尼 + 抗 PD-1 （Combi） 治療（圖5A）。作者的結果表明，與 CTRL 組相比，單獨使用奧希替尼組小鼠的腫瘤體積和生存時間沒有顯著差異。PD-1 抑制劑對 EGFR-TKI 耐藥腫瘤表現出部分抑制，并導致小鼠存活時間適度延長，盡管沒有統計學意義。然而，奧希替尼和抗 PD-1 的組合顯著抑制了腫瘤生長并延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖5B，C）。以上結果表明，抑制 PD-1 與 EGFR-TKI 聯合有效抑制了 EGFR-TKI 耐藥腫瘤的生長。

此外，作者進一步確定了在耐藥細胞中穩定敲低 PD-L2 是否可以增強這些細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性，為了區分 PD-L1 和 PD-L2 的作用，作者生成了 PD-L1 和 PD-L2 穩定沉默的 PC9R 細胞系。與 PD-L1 沉默細胞相比，PD-L2 沉默的腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，它們更有效地增加了 T 細胞的增殖和 CD8+?T 細胞的比例（圖5D，E）。此外，作者使用抗體阻斷 PD-L1、PD-L2 和 PD-1 的功能獲得了一致的結論。抗 PD-L2 和 PD-1 的抗體使腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，并增加了 T 細胞的增殖，CD8+ T 細胞的比例更高（圖5F， G）。上述體內和體外實驗表明，PD-L2 的高表達通過影響免疫反應來影響 EGFR 突變細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。因此，PD-1/PD-L2 信號傳導，而不是 PD-1/PD-L1 信號傳導，可能在介導對 EGFR-TKI 的耐藥中發揮重要作用。

• PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥

接下來，作者進一步探討了 PD-L2 表達升高影響免疫反應以降低腫瘤對 EGFR-TKIs 敏感性的機制。作者獲得了來自空載體或 PD-L2 過表達的同基因小鼠中 CT26-EGFR19del?細胞的腫瘤組織的單細胞轉錄組譜。作者對來自空載體樣本和 PD-L2 過表達樣本的整合單細胞數據集進行了聚類分析，并確定了六個主要的不同細胞群（圖6A、B）。作者發現 PD-L2 過表達組中癌細胞的數量顯著增加，T 細胞的比例顯著降低（圖6C）。為了探索 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者分析了癌細胞的轉錄組特征。與空載體組相比，對 PD-L2 過表達組的差異表達基因進行 KEGG 富集分析。作者觀察到細胞凋亡通路顯著富集（圖 6D）。GSEA 分析顯示，PD-L2 過表達組癌細胞中與細胞凋亡途徑相關的基因顯著下調（圖6E）。這些結果表明，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 表達的增加可導致細胞凋亡減少。作者的體內實驗數據進一步驗證了這些結論。TUNEL 染色顯示，與對照組相比，TKI 處理后 CT26-EGFR19del?PD-L2 過表達組腫瘤細胞凋亡受到顯著抑制（圖6F）。基于這些結果，作者假設 EGFR 突變的腫瘤細胞中 PD-L2 表達增加會抑制癌細胞的凋亡，從而導致癌細胞的持續生長，耐藥性增加。

• PD-L2 過表達抑制 CD8+T 細胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導腫瘤細胞凋亡的功能

為了進一步了解 PD-L2 對腫瘤免疫環境的抑制作用，作者回到了作者的單細胞測序數據。根據 CD45 的表達，將空載體和 PD-L2 過表達組的腫瘤環境中細胞分為 CD45-?腫瘤細胞和 CD45+?免疫細胞（圖7A）。然后根據已知遺傳標記的表達和細胞亞群的特異性注釋對 CD45+?免疫細胞進行分組（圖 7B）。在 PD-L2 過表達組中，作者觀察到 CD8+?T 細胞群的大小顯著減小（圖7B，C）。因此，作者通過 KEGG 富集分析了空載體組和 PD-L2 過表達組 CD8+?T 細胞中的差異表達基因（圖 7D）。作者發現與增殖和細胞毒功能相關的通路顯著富集（圖7E）。為了進一步證實 PD-L2 過表達顯著影響 CD8+?T 細胞活性，作者從總 T 細胞中分離 CD8+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養。結果顯示，CD8+?T 細胞的增殖在 PD-L2 過表達細胞中受到顯著抑制，而在 PD-L1 過表達細胞中則不受抑制（圖7F）。然后，作者從總 T 細胞中分離 CD4+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養。值得注意的是，PD-L2 過表達對 CD4+?T 細胞的增殖沒有影響，而 PD-L1 過表達顯著抑制了 CD4+?T 細胞的增殖（圖7G）。這表明 PD-L2 和 PD-L1 介導 T 細胞抑制的分子機制存在差異。

許多研究表明，CD8+?T 細胞可通過 Fas-FasL 通路或穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導腫瘤細胞凋亡。因此，作者接下來使用純化的 CD8⁺?T 細胞與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養，并研究 EGFR-TKIs 處理后腫瘤細胞的凋亡情況。結果顯示，與 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達減少了 EGFR-TKI 處理后 CD8+?T 細胞介導的腫瘤細胞凋亡（圖7H）。接下來，作者試圖檢查腫瘤細胞 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 CD8+?T 細胞分泌細胞毒性細胞因子的影響。正如預期的那樣，與 PD-L1 過表達相比，PD-L2 過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞顆粒酶 B 和穿孔素伴隨 EGFR-TKI 治療的分泌（圖7I）。綜上所述，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 的過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞的增殖和細胞毒功能，主要是通過抑制穿孔素和顆粒酶 B 的分泌，從而減少腫瘤細胞的凋亡。

• ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評價

由于目前市場上沒有靶向 PD-L2 的藥物，作者使用 HTRF 技術篩選了 1300 多種天然小分子化合物的庫，以鑒定 PD-L2 的特異性抑制劑。作者發現了一種小分子化合物十一烯酸鋅 （ZU），它選擇性地抑制 PD-L2/PD-1 結合，EC50?8.4 μM，而 PD-L1/PD-1 為 >80 μM（圖8A， B）。ZU 是由蓖麻油通過一系列化學反應和凈化過程生產的。CETSA 實驗表明，與 PD-L1/PD-1 相比，ZU 有效抑制了 PD-L2 與 PD-1 的結合（圖8C）。這些結果表明 ZU 具有阻斷 PD-L2/PD-1 相互作用的特異性能力。此外，作者利用空載體或 PD-L2 過表達的小鼠 CT26 細胞來驗證 ZU 的體外抗腫瘤作用。在 40 μM 濃度下，ZU 不會顯著降低 CT26 空載體和 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D），這表明 ZU 沒有直接的細胞毒性作用。然而，當腫瘤細胞與活化的 T 細胞共培養時，與 CT26 空載體細胞相比，ZU （40 μM） 顯著抑制了 CT26 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D）。這表明 ZU 通過靶向 PD-L2/PD-1 的免疫調節發揮抗腫瘤作用。使用具有空載體和 PD-L2 過表達的 PC9 細胞獲得了類似的結果（圖8D）。此外，作者研究了 ZU 和 EGFR-TKI 對親本和 TKI 耐藥 NSCLC 細胞的聯合抑制作用。對于耐藥細胞，結果表明，厄洛替尼聯合 ZU 對 827 R 或 PC9R 細胞的生長抑制具有協同作用，與單獨使用厄洛替尼相比，耐藥細胞的存活率顯著降低（圖8E）。重要的是，在沒有活化的 T 細胞的情況下，厄洛替尼聯合 ZU 的細胞殺傷效果沒有顯著差異（圖8E）。上述結果進一步表明，靶向 PD-L2 的 ZU 與 EGFR-TKI 的組合對耐藥腫瘤表現出協同抑制作用。

接下來，作者評估了 ZU 是否通過靶向 PD-L2 可以改善腫瘤免疫反應。流式細胞術分析顯示，與單獨使用厄洛替尼或 ZU 相比，厄洛替尼聯合 ZU 顯著增加了 CD8+?T 細胞的比例和顆粒酶 B 的表達（圖8F，G）。作者進一步檢測到與活化 T 細胞共培養的 827 個 R 或 PC9R 細胞的凋亡水平。作者發現厄洛替尼聯合 ZU 顯著促進免疫細胞介導的 EGFR-TKI 耐藥細胞凋亡（圖8H）。相比之下，當用厄洛替尼加 ZU 處理耐藥細胞時，在沒有活化的 T 細胞或細胞凋亡抑制劑（泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK 和特異性顆粒酶 B 誘導的細胞凋亡抑制劑 Z-IETD-FMK）的情況下未觀察到細胞凋亡（圖8H）。這進一步證明了耐藥細胞的凋亡是由免疫細胞介導的。此外，顆粒酶 B （Z-IETD-FMK） 的抑制有效地消除了細胞凋亡，突出了顆粒酶 B 在 ZU 和 EGFR-TKI 誘導的耐藥癌細胞凋亡中的關鍵作用（圖8H）。總之，這些結果表明天然小分子抑制劑 ZU 可以有效和特異性地抑制 PD-L2。當與 EGFR-TKIs 聯合使用時，ZU 可以通過在體外激活免疫細胞介導腫瘤細胞凋亡來顯著逆轉腫瘤細胞的耐藥性。

• ZU 改善抑制性腫瘤免疫環境，在體內逆轉 EGFR-TKIs 耐藥

為了進一步證實 ZU 和 EGFR-TKIs 的組合協同改善腫瘤免疫環境并逆轉腫瘤耐藥性，作者評估了 ZU + 厄洛替尼在攜帶 PD-L2 過表達的 CT26-EGFR19del?來源的腫瘤的 BALB/c 同基因小鼠中的療效（圖9A）。腫瘤體積曲線顯示，與鹽水處理組相比，單獨使用厄洛替尼在治療 15 天后表現出邊緣性腫瘤生長抑制（圖9B），這表明 PD-L2 的過表達增加了腫瘤細胞對 TKI 的耐藥性。ZU 單次治療并未阻斷腫瘤生長（圖9B），這表明單獨靶向 PD-L2 不能逆轉厄洛替尼耐藥性。正如預期的那樣，陽性對照組 （Er + ADVshPD-L2） 在所有測試的模型中反應最好（圖9B）。此外，ZU + 厄洛替尼組與陽性對照組相比沒有顯著差異，這表明 ZU 可以有效抑制 PD-L2，并且當與厄洛替尼聯合使用時，可以顯著逆轉厄洛替尼耐藥性（圖9B）。此外，流式細胞術和免疫組化結果顯示，聯合治療增加了腫瘤組織中浸潤白細胞（CD45+）的比例、T 細胞的活化 （CD3+CD69+）以及CD8+?T 細胞（CD8⁺GzmB+）的比例和功能（圖9C）。免疫組化顯示，聯合治療顯著抑制了增殖（圖9D）。為了全面評價 EGFR-TKIs 聯合 ZU 的療效，作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26 EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水（CTRL）、單獨 EGFR-TKIs、 單獨 ZU和EGFR-TKIs + ZU處理。作者的結果表明，與生理鹽水組相比，單獨使用 EGFR-TKIs 組或單獨使用 ZU 組小鼠的生存時間沒有顯著差異（圖9E， F）。然而，ZU 和 EGFR-TKIs（奧希替尼或厄洛替尼）的組合顯著延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖9E，F）。這些結果表明，ZU 聯合 EGFR-TKIs 可以通過改善同基因小鼠模型中的腫瘤免疫環境來有效逆轉對 EGFR-TKIs 的耐藥性。綜上所述，ZU 通過抑制 PD-L2 增強 CD8+?T 細胞的功能，其與 EGFR-TKIs 的聯合作用可有效抑制耐藥腫瘤的增殖。

研究總結

在該研究中，由于難以獲得對?EGFR-TKIs?耐藥的臨床腫瘤樣本，作者使用轉染人?EGFR?突變體 （外顯子19?缺失） 的小鼠細胞系建立?EGFR-TKI?耐藥同基因小鼠模型約五個月，這是使用基因工程小鼠難以實現的。值得注意的是，該研究的?TKI?耐藥模型的關鍵點是將初始抑制率與不同傳代模型中的抑制率進行了比較，例如?Os?治療的?LLC?從?44%?到?-12.3%，Er?治療的?CT26?從?55%?到?11.2%。因此，該研究認為該模型可以反映臨床?TKI?給藥中的耐藥過程。這種方法使作者能夠研究?EGFR-TKIs?治療過程與腫瘤免疫環境之間的關系。作者的結果表明，EGFR-TKIs?對腫瘤免疫環境具有顯著而顯著的影響。當?EGFR-TKIs?治療有效時，抗腫瘤免疫反應增強。然而，當發生耐藥性時，作者觀察到腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低，CD8+?T?細胞的比例和功能降低。不斷變化的腫瘤免疫環境可能是?PD-1?阻斷治療后立即再次用?EGFR-TKIs?攻擊對?EGFR-TKI?耐藥的?NSCLC?患者有效的原因 。此外，作者得出結論，抑制性腫瘤免疫環境是參與對?EGFR-TKIs?耐藥的機制之一。因此，作者從非遺傳角度揭示了?EGFR-TKIs 耐藥的新機制。