近日,?天津醫科大學基礎醫學院在cell?reports雜志在線發表了研究論文”Single-cell?and?spatial?transcriptomics?reveal?the?pathogenesis?of?chronic?granulomatous?disease?in?a?natural?model”。

研究背景

慢性肉芽腫病（Chronic?Granulomatous?Disease,?CGD）是一種由NADPH氧化酶2（NOX2）復合體功能缺失突變引起的原發性免疫缺陷病。這種缺陷會導致產生ROS的多種先天免疫細胞受到損害，機體抵御微生物的能力下降，導致CGD患者易發生反復感染和過度炎癥反應。本研究通過構建自然CGD小鼠模型，結合單細胞轉錄組（scRNA-seq）和空間轉錄組技術（包括BMKMANU?S1000平臺），深入解析了CGD肺部肉芽腫形成的細胞與分子機制，從CGD肺肉芽腫組織中鑒定出具有NOS2高表達特征的中性粒細胞和MMP12+巨噬細胞，并提出MIF和Morbidity為CGD治療的潛在靶點。

研究內容及結果

1、通過接觸清潔環境（CL）建立CGD肉芽腫模型

通過不同環境暴露（SPF或CL）實驗，系統研究了環境病原體對CGD遺傳背景小鼠表型的影響。表現為HE染色全肺葉顯微圖像可見CL環境下的Ncf2?/?小鼠肺部出現明顯的肉芽腫結構，伴隨炎癥細胞浸潤和組織壞死，其他組小鼠肺部正常。免疫熒光顯示肉芽腫中的巨噬細胞（CD68+）表達上皮標志物E-cadherin，提示巨噬細胞發生上皮樣轉化。通過ELISA法檢測CL?Ncf2?/?小鼠血清中的IL-1β和IFN-γ炎癥相關蛋白水平較CL?WT組增加。16S?rRNA/ITS?測序顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺部細菌（如克雷伯菌和葡萄球菌）和真菌（如Talaromyces）負荷顯著增加。

2、單細胞分辨率下小鼠肺部免疫景觀的分析

通過單細胞RNA測序和流式細胞術分析發現CGD小鼠肺部炎癥微環境以髓系細胞浸潤為主，提示其參與肉芽腫形成。其中單細胞測序，最終保留了25296個高質量細胞樣本，每個細胞平均包含6466條比對讀數和1972個基因，并識別出9種免疫細胞類型及九種基質細胞類型。還發現一個以細胞周期相關基因（Mki67和Top2a）高表達為特征的細胞簇。通過流式細胞術分析發現，CL?Ncf2?/?小鼠中CD11b高表達的F4/80+MDMs在比例和絕對數量上均顯著增加，這些結果揭示了慢性肉芽腫性葡萄膜炎（CGD）小鼠在肺部感染過程中免疫細胞組成的顯著變化，尤其是中性粒細胞和MDMs的明顯聚集現象。

3、CGD小鼠中性粒細胞的轉錄改變

研究顯示，中性粒細胞分為6個亞群，其中Neu6亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著擴增且Neu6高表達促炎基因（如Nos2、Mif、Tnf、Il1b）。NO是一種在病原體清除過程中起關鍵作用由NOS2合成的可擴散小分子，CL?Ncf2?/?小鼠肺部的總NO生成量顯著升高。流式驗證顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺中NOS2high中性粒細胞比例顯著增加。這些結果均提示NOS2high中性粒細胞通過產生一氧化氮（NO）和促炎因子，驅動肉芽腫核心區的炎癥反應。

4、CGD小鼠單核細胞-巨噬細胞區室的轉錄改變

通過對巨噬細胞亞群進行聚類分析和功能富集，發現巨噬細胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時表達M1（Nos2）和M2（Arg1）標志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結果提示MMP12+巨噬細胞具有混合表型，可能通過細胞外基質重塑促進肉芽腫的纖維化包裹。

5、空間轉錄組揭示肉芽腫結構

使用SeekSpace和BMKMANU?S1000平臺分析肺組織切片的空間轉錄組。研究表明肉芽腫核心區富集中性粒細胞（Neu6亞群），外圍富集巨噬細胞（Mac1亞群）和成纖維細胞。Mac1高表達促炎（Nos2）和促纖維化（Mmp12、Fn1）基因。成纖維細胞高表達膠原基因（Col1a1、Col4a1），提示其參與纖維化。

以上結果提示通過BMKMANU?S1000平臺進行的空間轉錄組發現Neu6占據肉芽腫中心區域，而Mac1和成纖維細胞在外圍區域參與細胞外基質重塑和纖維化包被過程。明確了肉芽腫中不同細胞的分布和功能分工，揭示了炎癥與纖維化的協同作用。

6、干預策略的效果驗證

通過對巨噬細胞亞群進行聚類分析和功能富集，發現巨噬細胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時表達M1（Nos2）和M2（Arg1）標志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結果提示MMP12+巨噬細胞具有混合表型，可能通過細胞外基質重塑促進肉芽腫的纖維化包裹。

研究總結

首次通過環境暴露構建自然CGD模型，結合多組學技術解析肉芽腫的細胞和分子機制。本研究揭示了CGD肉芽腫中NOS2high中性粒細胞和MMP12+巨噬細胞的協同作用，并提出MIF和Morrbid作為潛在治療靶點，為CGD的精準干預提供了理論基礎。BMKMANU?S1000空間轉錄組通過高分辨率空間定位明確揭示了中性粒細胞（Neu6亞群）在肉芽腫核心、巨噬細胞（Mac1亞群）和成纖維細胞在外圍的分布。在基因表達驗證時確認了NOS2、MIF、IL-1β等基因在肉芽腫不同區域的差異表達，這一結果與scRNA-seq結果高度一致，展示了BMKMANU?S1000在疾病微環境研究中的高效性。