中文標(biāo)題:?揭示鋁對(duì)苦草葉附著生物膜微生物群落演替的生態(tài)機(jī)制：微生物相互作用的新見(jiàn)解

英文標(biāo)題:?Unraveling the ecological mechanisms of Aluminum on microbial community succession in epiphytic biofilms on?Vallisneria natans?leaves: Novel insights from microbial interactions

期刊名稱：Journal of Hazardous Materials

影響因子：13.6

合作單位：淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所）

研究對(duì)象：苦草葉片附著生物膜

測(cè)序技術(shù)：二代微生物多樣性（16s/18s）

百邁客生物在該研究中提供了二代微生物多樣性（16s/18s）技術(shù)服務(wù)。

研究背景

苦草是一種廣泛分布在我國(guó)淡水水體中的多年生沉水植物，它經(jīng)常被用作水生態(tài)恢復(fù)的先鋒物種。在此背景下，重點(diǎn)研究了不同濃度鋁（Al）暴露下，苦草葉片附著生物膜中的微生物群落特征和微生物食物網(wǎng)的響應(yīng)。該研究假設(shè)如下：(1)?暴露于Al會(huì)引起苦草葉片附著生物膜形態(tài)特征的改變，同時(shí)影響這些生物膜內(nèi)細(xì)菌和微型真核生物的組成和多樣性；(2) Al暴露會(huì)導(dǎo)致附著生物膜內(nèi)微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性發(fā)生變化，從而重塑生物膜內(nèi)微生物之間的相互作用；(3)為響應(yīng)Al暴露，苦草可能表現(xiàn)出生理適應(yīng)性。

該研究旨在解析Al對(duì)沉水植物和微生物群落的毒性作用，強(qiáng)調(diào)在水生生態(tài)系統(tǒng)中控制適當(dāng)?shù)腁l濃度對(duì)保護(hù)微生物多樣性、維持生態(tài)功能和加強(qiáng)湖泊修復(fù)重要作用。

材料方法

基于16s rRNA基因及18s rRNA基因測(cè)序分析不同濃度Al暴露后苦草葉附著生物膜的細(xì)菌和微型真核生物組成。

研究結(jié)果

1.苦草葉片附著生物膜的結(jié)構(gòu)特征

隨著Al濃度的升高，葉片上的生物膜聚集情況逐漸增加。利用多重?zé)晒馊旧虲LSM，我們觀察了Al處理下生物膜組分的不同性質(zhì)，注意到核酸濃度在1.2 mg/L組達(dá)到峰值(圖1c)。藻類密度和附著生物膜厚度隨Al濃度的增加而增加，1.2 mg/L組最大厚度為101.94μm，CK組為34.50μm(圖1e)。結(jié)果表明，鋁處理促進(jìn)了苦草附著生物膜的生長(zhǎng)。所觀察到的現(xiàn)象可能歸因于Al離子分散到水生環(huán)境中，隨后與水體中的氮和磷形成聚集體。這些聚集體通過(guò)沉降作用積聚在沉水植物葉片表面，增加附著生物膜內(nèi)的氮和磷含量，促進(jìn)附著微生物的生長(zhǎng)。

圖1-附著微生物在苦草葉片上的空間分布的CLSM 3D圖像（a-d）和生物膜的厚度（e）。生物膜被染色具有藍(lán)色（核酸）、綠色（胞外多糖）和紅色（葉綠體）

2.附著生物膜中細(xì)菌多樣性和豐度的變化

利用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)對(duì)附著生物膜的細(xì)菌群落復(fù)雜性進(jìn)行了評(píng)價(jià)：

第7天，Shannon多樣性指數(shù)為5.62~6.21，各組間差異不顯著(P>0.05)。而1.2 mg/L濃度組的Chao1指數(shù)(770.86±23.46)顯著高于對(duì)照組，表明物種豐富度增加(圖2a)；

第14天，CK和0.6 mg/L組的Shannon多樣性均高于1.2和2.0 mg/L組(圖2a)，處理間Chao1指數(shù)無(wú)顯著變化(圖2b, P>0.05)；

在第21天，2.0 mg/L組的Shannon和Chao1指數(shù)顯著降低，表明Al脅迫導(dǎo)致多樣性和豐富度降低(圖2a、2b；P<0.05)。

這種影響可歸因于高Al水平對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的有害影響，包括細(xì)胞裂解，DNA降解，代謝酶活性的破壞，損傷細(xì)胞膜通透性，以及通過(guò)消除敏感物種而導(dǎo)致的細(xì)菌群落多樣性的減少。采用PCoA觀察不同濃度鋁對(duì)附著生物膜細(xì)菌群落的影響，結(jié)果表明，在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)(第7天、第14天、第21天)，PCoA分別占細(xì)菌群落方差的52.6%、71.94%和75.85%(圖2d、2e、2f)。0.6 mg/L處理與CK處理第7天細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似。暴露21天后，四個(gè)處理組間差異明顯，說(shuō)明Al暴露顯著改變了細(xì)菌群落組成(P<0.05；圖2d)。

圖2-暴露7天、14天和21天的樣品中附著生物膜中細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)（a）和Chao 1指數(shù)（b），不同的字母表示四種處理之間的顯著差異（P < 0.05）。數(shù)據(jù)表示平均值± S.E（n=3）。（c），（d）和（e）是分別暴露7天、14天和21天細(xì)菌群落的β多樣性，由PCoA基于Bray-Curtis差異顯示。

門(mén)水平的細(xì)菌群落組成結(jié)果顯示了微生物群落對(duì)Al暴露的動(dòng)態(tài)響應(yīng)(圖3a)。變形菌門(mén)(28.64% ~ 68.58%)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(14.15% ~ 43.74%)、厚壁菌門(mén)(0.48% ~ 33.24%)和擬桿菌門(mén)(2.10% ~ 15.60%)是所有附著生物膜樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群，廣泛存在于苦草葉片的附著生物膜。同時(shí)，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在各處理組中均占優(yōu)勢(shì)地位。然而，在濃度分別為1.2 mg/L和2.0 mg/L的Al處理21天后，兩個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度均顯著低于CK組，說(shuō)明這些細(xì)菌的增殖受到了Al暴露的影響。

總的來(lái)說(shuō)，Al暴露確實(shí)改變了細(xì)菌群落的多樣性和組成，從而影響了苦草上附著生物膜降解污染物的生態(tài)功能。屬水平上優(yōu)勢(shì)屬依次為uncultured_bacterium_f_burkholderaceae(5.21 ~ 18.32%)、Exiguobacterium?(0.06 ~ 32.48%)、Limnobacter(1.83 ~ 28.81%)、Limnothrix(0.25 ~ 24.56%)、Zavarzinia(0.49 ~ 14.53%)、Schizothrix_LEGE_07164?(0.86 ~ 8.69%)、Pseudanabaena_PCC-7429(0.23 ~ 6.65%)。在實(shí)驗(yàn)的第14天和第21天，各處理組的Exiguobacterium細(xì)菌豐度均顯著增加。相反，burkholderaceae, Limnobacter和Zavarzinia表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，它們的豐度隨著處理時(shí)間的推移而減少(圖3b)。

圖3-每個(gè)生物膜樣品中相對(duì)豐度最高的十個(gè)細(xì)菌門(mén)（a）和屬（b）。D7、D14和D21表示第7天、第14天和第21天。圓圈（b）與所有樣本中每個(gè)屬的相對(duì)豐度成比例。

3.附著生物膜中微型真核生物多樣性和相對(duì)豐度的變化

微型真核生物群落在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，特別是在附著生物膜中，它們占據(jù)著專門(mén)的生態(tài)位。盡管它們具有重要的生態(tài)學(xué)意義，但我們對(duì)沉水植物附著生物膜中的微型真核生物群落多樣性和組成的了解仍然有限，特別是在Al暴露下。本研究以18s rRNA基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，利用Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)對(duì)微型真核生物群落的多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)第7天，Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為5.41 ~ 5.79和321.04 ~ 346.47，各組間差異不顯著(圖4a、4b)。第14天，CK組Shannon指數(shù)(4.76±0.24)顯著低于其他處理組(圖4a、4b, P < 0.05)。隨著時(shí)間的推移(第21天)，0.6、1.2和2.0 mg/L處理的Shannon指數(shù)分別為4.84±0.24、4.59±0.30和4.57±0.21，顯著高于CK組(3.96±0.12)(圖4a、4b, P < 0.05)。此外，利用PCoA分析，我們確定了微型真核生物群落結(jié)構(gòu)的顯著時(shí)間演替模式，在實(shí)驗(yàn)期間，處理組和CK組之間的β多樣性存在顯著差異。

圖4-暴露7天、14天和21天的樣品中附著生物膜中微型真核生物群落的Shannon指數(shù)（a）和Chao 1指數(shù)（b），不同的字母表示四種處理之間的顯著差異（P < 0.05）。數(shù)據(jù)表示平均值± S.E（n=3）。（c），（d）和（e）是分別暴露7天、14天和21天細(xì)菌群落的β多樣性，由PCoA基于Bray-Curtis差異顯示。

根據(jù)注釋結(jié)果，在所有樣本中鑒定出10個(gè)優(yōu)勢(shì)的微型真核生物門(mén)，分別是Chlorophyta(8.71–34.25%)，Intramacronucleata (10.69–30.43%)，Diatomea (2.11–30.24%), Platyhelminthes (0.02–22.00%)，Annelida (0.04–20.60%), Cryptomycota (0.21–11.99%)， Streptophyta (1.84–8.37%)，Rotifera (0.52–7.23%)，Cercozoa (0.91–6.45%)，Chytridiomycota (0.07–6.42%) (圖5a)。值得注意的是，在處理組中Rotifers的豐度顯著增加(圖5a)。在實(shí)驗(yàn)后期，尤其是處理組，Platyhelminthes 和 Annelida的相對(duì)豐度有所增加(圖5a)。

如圖5b所示，微型真核生物屬相對(duì)豐度前10位依次為Cocconeis?(1.18-28.89%)、VorticellaDaphnia_pulex?(3.93-22.79%)、Oedogonium?(3.46-20.48%)、Gieysztoria(0.01-19.52%)、Coleochaete(1.80-8.31%)、Stenostomum(0-5.93%)、Spathidiopsis(0.01-10.55%)、Ptygura(0.17-2.68%)、Choanocystis(0.06-4.83%)、Vorticella(0.21-3.05%)。Al離子干擾硅藻體中二氧化硅的溶解被認(rèn)為是一種潛在的機(jī)制。這種干擾影響了硅藻細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，這可能解釋了0.6 mg/L和1.2 mg/L Al處理組硅藻(Cocconeis)豐度低于CK組的原因。

圖5-每個(gè)生物膜樣品中相對(duì)豐度最高的十個(gè)微型真核生物門(mén)（a）和屬（b）。D7、D14和D21表示第7天、第14天和第21天。圓圈（b）與所有樣本中每個(gè)屬的相對(duì)豐度成比例。

4.細(xì)菌和微型真核生物群落的組裝和共生模式

一般來(lái)說(shuō)，微生物群落的聚集受到確定性和隨機(jī)過(guò)程的影響。對(duì)于細(xì)菌群落的聚集，異質(zhì)性選擇的生態(tài)過(guò)程是主要的確定性過(guò)程，而均勻化擴(kuò)散則貢獻(xiàn)了大部分的隨機(jī)過(guò)程(圖6a, 6c)。值得注意的是，確定性過(guò)程對(duì)細(xì)菌群落的影響從CK組的44.4%增加到2.0 mg/L Al處理組的55.5%，這表明Al暴露加劇了選擇壓力，從而降低了隨機(jī)性在群落聚集中的作用。猜測(cè)可能與營(yíng)養(yǎng)無(wú)關(guān)的干擾增強(qiáng)了生態(tài)位選擇，減少了優(yōu)先效應(yīng)，導(dǎo)致隨機(jī)過(guò)程的影響降低。隨著Al濃度的增加，微型真核生物群落組裝的確定性過(guò)程從CK組的8.3%增加到2.0 mg/L組的13.8%。表明在微型真核生物群落的組裝過(guò)程中，隨機(jī)過(guò)程比確定性過(guò)程發(fā)揮更重要的作用(圖6b、6d)。在隨機(jī)過(guò)程中，homogenizing dispersal過(guò)程(44.4%、47.2%、52.7%和38.8%)是微型真核生物群落組裝過(guò)程中最關(guān)鍵的過(guò)程，其次是undominated過(guò)程(圖6b、6d)。NCM進(jìn)一步量化了中性理論的貢獻(xiàn)，確定了在預(yù)測(cè)的隨機(jī)分布范圍內(nèi)。這些分析強(qiáng)調(diào)，確定性和隨機(jī)過(guò)程都協(xié)調(diào)了附著生物膜中微生物群落的組裝。對(duì)Al脅迫的反應(yīng)，細(xì)菌群落表現(xiàn)得比微型真核生物群落的更明顯的反應(yīng)。這種不同的敏感性可能源于微型真核生物更大的細(xì)胞復(fù)雜性和功能多樣性，從而增強(qiáng)了生態(tài)位適應(yīng)能力，減輕了選擇壓力下環(huán)境過(guò)濾的影響。

Al處理組(1.2 mg/L和2.0 mg/L)細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的平均程度、邊數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度高于CK組。表明Al處理增強(qiáng)了細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。在微型真核生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中觀察到相反的模式。其中，平均程度、邊數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度CK均高于處理組。表明Al處理降低了微型真核生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，微生物物種之間的相互關(guān)系相對(duì)稀疏。

微生物之間相互作用復(fù)雜性的增加有助于提高它們之間物質(zhì)交換的效率，并增強(qiáng)對(duì)外部壓力的抵抗力。在Al處理組中觀察到的微型真核生物網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的降低，表明微型真核生物群落的穩(wěn)定性降低，其對(duì)外部壓力源的恢復(fù)能力降低。暴露于Al后，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中正邊的比例降低，而微型真核生物網(wǎng)絡(luò)中正邊的比例增加，與細(xì)菌群落相比，Al處理組的微型真核生物群落的合作水平更高。

圖6-不同處理組中細(xì)菌（a）和微型真核生物（b）的βNTI分布。細(xì)菌（c）和微型真核生物（d）群落組裝的周轉(zhuǎn)百分比主要由不同的隨機(jī)過(guò)程（dispersal limitation and homogenizing dispersal）和確定性過(guò)程（homogeneous selection）決定，以及處理中不受任何單一過(guò)程（Undominated）控制的百分比。

5.關(guān)鍵類群的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析及其相互作用模式的差異

探索復(fù)雜多樣的微生物群落中的相互作用模式可以為研究Al脅迫如何影響微生物群落動(dòng)態(tài)提供新的見(jiàn)解。CK、0.6 mg/L、1.2 mg/L和2.0 mg/L處理組的邊分別為204、284、256和319(表1)，表明處理組細(xì)菌與微型真核生物之間的相互作用更為復(fù)雜，可能提高附著生物膜系統(tǒng)的復(fù)雜性。總體而言，共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性隨著Al濃度的升高而上升，可能是Al脅迫下微生物群落的生存機(jī)制。

表1-不同處理組的微生物群落網(wǎng)絡(luò)的基本性質(zhì)

隨著Al濃度的增加，微生物群落間正相關(guān)比例從49.51% (0 mg/L)上升到57.05% (2.0 mg/L)，負(fù)相關(guān)比例從50.49% (0 mg/L)下降到42.95% (2.0 mg/L)(表1)。正相關(guān)可能代表了相互共生和捕食，負(fù)相關(guān)反映了資源競(jìng)爭(zhēng)。由此可以推斷，在Al暴露壓力下，微生物群落的成員表現(xiàn)出更多的合作或捕食。根據(jù)攝食模式，附著生物膜食物網(wǎng)被分為三個(gè)營(yíng)養(yǎng)水平：初級(jí)生產(chǎn)者(藻類和藍(lán)藻)、消費(fèi)者(后生動(dòng)物和原生動(dòng)物)和分解者(細(xì)菌和真菌)。Keystone類群在微生物共生網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用，其變化可導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化。CK組的重點(diǎn)分類群包括Methylomultilis、Nevskia、Caulobacter、Methylophilus、Cocconeis、Chlorochytrium、Oedogonium等(圖7a)。同樣，在0.6 mg/L處理組，主要分類群包括Zavarzinia, Nevskia, Methylophilus, Caulobacter等(圖7b，圖S8b)。值得注意的是，Chlorophyta成員Chlorochytrium和Oedogonium與Pseudomonadota和Bacteroidota表現(xiàn)出共生關(guān)系，通過(guò)光合作用衍生的細(xì)胞外基質(zhì)和養(yǎng)分釋放促進(jìn)細(xì)菌定殖。這種藻類和固氮細(xì)菌之間的協(xié)同作用在維持生物膜群落、促進(jìn)恢復(fù)力和污染物修復(fù)效率方面起著關(guān)鍵作用，強(qiáng)調(diào)了生物膜生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互依賴關(guān)系。在1.2 mg/L Al處理組中，觀察到Keystone類群由細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)樵孱悾殡S著分解者和消費(fèi)者的減少，表明微生物群落的養(yǎng)分去除能力可能會(huì)減弱，因?yàn)榧?xì)菌在養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物降解中起著至關(guān)重要的作用。但其中Cyanobacteriota的Cyanothece_PCC_7425和Pseudanabaena_PCC-7429與其他分類群表現(xiàn)出不利的相互作用，這暗示微囊藻毒素的產(chǎn)生可能抑制競(jìng)爭(zhēng)微生物的生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明，在1.2 mg/L的Al濃度下，捕食者豐度減少，促進(jìn)藻類增殖，從而通過(guò)破壞捕食動(dòng)態(tài)改變微生物群落組成，強(qiáng)調(diào)了自上而下控制附著生物膜微生物群落的重要性。在2.0 mg/L Al處理組中，觀察到光合生產(chǎn)者的豐度顯著下降，可能是由于Al毒性損害了生物膜內(nèi)真核藻類的生長(zhǎng)(圖7d，圖S8d)。與對(duì)照組相比，該處理顯示出獨(dú)特的關(guān)鍵類群，如Exiguobacterium(Bacillota)、IMCC26134 (Verrucobacterium)和Ptygura (Rotifers)，強(qiáng)調(diào)了微生物共生網(wǎng)絡(luò)中有機(jī)物分解和捕食的優(yōu)勢(shì)。有研究證明，Exiguobacterium可以在極端環(huán)境中生長(zhǎng)，并對(duì)Cyanobacteriota的物種表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制作用，這可以解釋為什么其在2.0 mg/L Al處理組處于優(yōu)勢(shì)。

圖7-不同處理組附著生物膜中細(xì)菌和微型真核生物群落的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，（a）CK，（b）0.6 mg/L，（c）1.2 mg/L，（d）2.0 mg/L。（圓圈代表物種，同一顏色屬于同一門(mén)，圓圈的大小代表豐度；線代表兩個(gè)物種之間的相關(guān)性，線的顏色：粉紅色代表正相關(guān)性，綠色代表負(fù)相關(guān)性）。

研究總結(jié)

本研究為闡明Al對(duì)苦草葉片附著生物膜內(nèi)細(xì)菌和微型真核生物群落的影響提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。結(jié)果表明，Al處理促進(jìn)了絲狀藻的生長(zhǎng)，導(dǎo)致附著生物膜厚度增加。高濃度的Al (2.0 mg/L)顯著降低細(xì)菌多樣性，但增強(qiáng)微型真核生物多樣性。與微型真核生物相比，Al處理對(duì)細(xì)菌群落的組裝過(guò)程影響更為深遠(yuǎn)。Al的影響擴(kuò)展到微生物相互作用的動(dòng)態(tài)，表現(xiàn)為共生網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵類群組成的變化，并促進(jìn)微生物之間的合作增加。這種變化可能潛在地破壞附著生物膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性。

此外，該研究強(qiáng)調(diào)了苦草的適應(yīng)性策略，特別是其抗氧化反應(yīng)，作為抗Al誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的防御機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)有助于更深入地了解水生環(huán)境中不斷上升的Al水平所帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。此外，他們還為在日益增長(zhǎng)的環(huán)境壓力下有效的湖泊修復(fù)工作提供了指導(dǎo)，強(qiáng)調(diào)了管理Al濃度以保護(hù)微生物多樣性和維持生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)的迫切需要。