研究背景

抗凍性不僅決定著植物的地理分布，而且影響著作物、蔬菜和水果的產量，已成為溫帶和北溫帶地區人們關注的焦點。植物通過一個稱為“低溫馴化”的過程來增加它們的抗凍性，而通過“脫馴化”失去抗凍性。低溫馴化是一個多基因調控的過程，伴隨著植物的生理調節。多年生木本植物的低溫馴化通常包括兩個階段，分別由短光周期和低溫誘導。盡管多年生木本植物對光周期和低溫的表型反應已經被了解得很清楚，但在分子水平上知之甚少。

在這篇文章中，研究者選用多年生木本植物杜鵑花屬的常綠品種‘ElsieLee’進行低溫馴化，其葉子在冬天變為紅色，春天又變成綠色，這為花青素在低溫馴化中的重要作用提供了機會。本研究結果可全面認識野外和人工低溫馴化的差異，為了解多年生木本植物越冬常綠葉片的低溫馴化奠定基礎。

研究方法

選3年生的“ElsieLee”杜鵑，用于田間或人工低溫馴化試驗，共3組試驗：ExperimentI田間低溫馴化（F-CA），ExperimentII人工低溫馴化（A-CA），ExperimentIII人工用紫外光B進行低溫馴化（A-CA+UVB）。每組試驗36盆，分為3個生物學重復，每個生物學重復12盆，采集當年生長的完全展開的葉子進行實驗，葉片在抽樣日期收集后立即在液氮中冷凍，然后-80℃保存。

研究結果

1、葉片耐凍性及花青素的積累

LT50為引起50%損傷的溫度，在試驗I中，10月26日（該日期下的樣品視為未馴化的樣品）平均溫度約為22℃，光照11.2h，此時LT50為-4.3℃。試驗II和III在人工低溫馴化前處在營養生長階段，溫度為25℃，光照16h，LT50為-4.2℃。

F-CA（10月26日-1月20日）期間，LFT隨溫度降低和光照減少而增強，1月20日，葉片組織獲得整個F-CA期最強的LFT（LT50為-18.5℃）。A-CA（4℃）或UVB（4℃+紫外光B）馴化56天后，LFT提高至-10℃。F-CA中，葉片花青素含量逐漸增加，但在A-CA中沒有明顯變化，而在UVB中，處理14天后，花青素開始增加，處理56天后，花青素的濃度約為1月20日F-CA處理時的一半。結合A-CA和UVB的LFT數據，花青素本身是否增強了LFT尚不清楚。

2、轉錄組測序、主要成分分析，以及在田間和人工低溫馴化過程中差異表達基因的鑒定

根據LFT和花青素的生理變化，選擇5個樣本進行轉錄組分析，每個樣本三個生物學重復（圖1a）。

轉錄組共鑒定出94,144個unigenes，N50為1800。所有unigenes被用來進行主成分分析（圖2a），結果顯示（i）每個樣本生物學重復功能上相似；（ii）主成分1（PC1）能將CA與非馴化分離，主成分2（PC2）能夠將F-CA與A-CA和A-CA+UVB分開；（iii）F-NA與A-NA的距離表明葉片在早秋與營養生長時的狀態是不同的。

三組試驗F-NAvs.F-CA（I）、A-NAvs.A-CA（II）及A-NAvs.A-CA+UVB（III）分別注釋了3023、1235和2620個差異表達基因，其中438個為共同差異表達基因，另有2229、122和1259個上調或下調基因分別為試驗I、II和III所特有的（圖2b）。

試驗I、II和III富集的KEGG通路分別為23、26和31個（圖2c）。其中8個為試驗I特有的，包括4個光合作用相關通路（KO00195、KO00196、KO00906和KO04146）及兩個脂肪酸代謝通路（KO00591和KO00592）。三組試驗共有的通路為11個，包括5個碳水化合物通路（KO00040、KO00053、KO00500、KO00630和KO01200）、3個次級代謝通路（KO00904、KO00940和KO00941）、1個氨基酸代謝通路（KO00410）、1個脂質代謝通路（KO00071）和1個晝夜節律通路（KO04712）（圖2c）。

3、在F-CA中的特異性富集的KEGG通路

KO00906為類胡蘿卜素生物合成途徑，在試驗I中富集（圖2c），該途徑導致ABA的生物合成和分解代謝（圖3a）。該通路中，3個被注釋為β-胡蘿卜素3-羥化酶（CHY-β）表達量上調（圖3b）。CHY-β將β-胡蘿卜素轉化為玉米黃素，玉米黃素在非光化學猝滅的熱耗散中起關鍵作用。一個被注釋為玉米黃素環氧化酶（ZEP）的差異基因表達下調。在葉黃素循環中，ZEP將玉米黃素/環氧玉米黃素轉化為紫黃素。因此，在試驗I中，玉米黃素的積累可能與CHY-βs上調及ZEP下調有關（圖3b）。

有趣的是，有5個注釋為ABA8-羥化酶（ABA8’ox），其中在F-NA中表達水平較低的ABA8’ox1-3在F-CA中表達上調，而ABA8’ox4-5在F-CA中受到抑制（圖3b），類胡蘿卜素是ABA的前體，而ABA是ABA8’ox的底物（圖3a）。ABA8’ox隨內源ABA水平的增加而上調。試驗I10月26日的ABA濃度是試驗II和試驗III0天處理的3倍左右(圖3c)，試驗I1月20日的ABA水平下降到試驗II和試驗III0天處理的水平(圖3c)。因此，ABA8’ox1-3可能參與了F-CA過程中ABA的分解代謝，而ABA8’ox4-5可能在非馴化條件下受高水平ABA誘導(圖3c)。

試驗I中，KO00591亞油酸代謝和KO00592α-亞麻酸代謝分別富集了7個和20個DEGs。這些途徑促進JA的生物合成(圖4a)。5個編碼脂氧合酶(LOX)的DEGs同時存在于這兩個途徑中且表達下調。α-亞麻酸和亞油酸都是多不飽和脂肪酸(PUFAs)和LOX的底物。α-亞麻酸代謝途徑的20個DEGs中有7個是上調的。其中5個被注釋為12-氧代植二烯酸還原酶(12-OPR3)，轉錄水平很低。另一個注釋為12-OPR3的基因在F-NA中高表達，而在F-CA中表達下調(圖4b)。

試驗I的茉莉酸含量在10月26日至1月20日期間大幅度下降了93%，試驗II在0~56天期間下降了66%；而在試驗III中，沒有明顯變化(圖4c)。AtLOX2和AtCYP74A(alleneoxidesynthase,AOS)已被證明是擬南芥JA生物合成的關鍵酶，其中任何一種的缺失都會抑制JA的生物合成。此外，NaLOX3參與了煙草中JA的積累。本研究中，13-LOXs和AOSs在試驗I和II中均下調(圖4b)，表明抑制亞麻酸的消耗可能是為了在應對低溫時保持膜的流動性。UVB被證明可以誘導擬南芥中JA的生物合成。因此，低溫抑制JA生物合成，而UVB處理可能導致整個試驗III中JA含量穩定(圖4c)。

KO00195光合作用、KO00196光合作用-天線蛋白和KO04146過氧化物酶體通路在試驗I中特異性富集(圖2c)，它們與光保護相關。在KO00196光合-天線蛋白通路中，DEGs被注釋為光捕獲復合物，9個DEGs中有4個表達下調，這4個下調的DEGs的轉錄水平(即FPKM值)均高于F-NA中的其他DEGs，表明這4個基因在植物中起著關鍵作用，冬季葉片組織試圖通過減少光收集復合物來降低對光能的吸收。

試驗I中葉綠素(a+b)含量從10月26日至1月20日(圖5a)降低了30%（圖5a），試驗II和III在0-56天處理后分別降低了23%和15%（圖5b）。這表明，隨著溫度的降低，葉片試圖通過降低葉綠素含量來降低光吸收。試驗I中，葉綠素a/b在10月26日至1月20日下降了15%(圖5c)；試驗II和III中，從0-56天分別減少8%和6%(圖5d)。葉綠素a/b的變化表明試驗I反應中心的降解比試驗II和III更嚴重。代表光系統II反應中心開放度的光化學猝滅(qP)在10月26日至1月20日，降低了57%(圖5e)，試驗II和III處理0~56天后，qP分別降低了43%和25%(圖5f)。葉綠素(a+b)、葉綠素a/b和qP在試驗I中下降得更多，說明光保護或光抑制作用更明顯。

在KO00195光合作用通路中，DEGs被注釋為負責電子傳遞、光系統I或II亞基以及ATP酶等活性蛋白。在KO04146過氧化物酶體通路中，8個被注釋為超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的DEGs表達上調。這兩種途徑中大部分DEGs的轉錄水平較低。

此外，除KEGG通路中富集的DEGs外，還有3個編碼早期光誘導蛋白(ELIPs)的DEGs。ELIPs在試驗I中被高度誘導表達，且表達上調的幅度比試驗II和III中要高。ELIPs定位于類囊體膜，它們結合葉綠素a并在光保護中發揮重要作用。它們的積累可以被各種生理條件觸發，包括光脅迫和低溫，并與光系統II反應中心降解相關。試驗I中ELIPs的表達顯著上調，說明F-CA中光保護或光抑制作用更明顯。

4、在F-CA和A-CA中普遍富集的KEGG通路

（1）碳水化合物的新陳代謝。屬于碳水化合物代謝的5個KEGG通路在三個試驗中都有富集（圖2c和圖6a）。

KO00053抗壞血酸和aldarate代謝、KO01200碳代謝、KO00630乙醛酸和二羧酸代謝途徑中，大部分DEGs在試驗I中表達上調，而在試驗II和試驗III中表達下調(圖6a)。在KO00040戊糖和葡萄糖醛酸轉化途徑中，試驗I的23個DEGs中有10個上調，試驗II的17個DEGs中只有2個上調，試驗III的25個DEGs中有3個上調(圖6a)。在KO00500淀粉和蔗糖代謝中，試驗I的32個DEGs中有14個上調，試驗II的21個DEGs中有9個上調，試驗III的33個DEGs中有10個上調(圖6a)。KO01200碳代謝圖（未展示）顯示，試驗I中磷酸戊糖途徑的所有DEGs和糖酵解過程中的大部分DEGs均上調，但在試驗II和試驗III中均下調。磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑屬于呼吸途徑，在碳水化合物代謝中起重要作用。這些數據表明，試驗I的碳水化合物代謝變化與試驗II和III不同，這可以通過糖含量的變化來證明(圖6b)。

試驗I中，10月26日至1月20日，葉片葡萄糖和果糖濃度分別增加了10倍和7倍(圖6b)。然而，試驗II和III中，從0-56天處理，葡萄糖和果糖分別僅增加了~1.6倍和2.7倍(圖6b)。試驗I在10月26日至1月20日期間葉片蔗糖濃度增加了1.3倍，試驗II和III在0~56天期間分別增加了1.2倍和1.3倍(圖6b)。這些結果表明，葡萄糖和果糖在抗凍性中比蔗糖更重要。

（2）花青素生物合成。KO00941類黃酮生物合成途徑在試驗I、II和III中富集的DEGs分別為8、8和11個，這些DEGs也參與了花青素的生物合成。試驗I中8個DEGs均上調，試驗II和III中分別有1個和3個DEGs表達下調（圖6c）。除FLS1、HCT和CHS4外，F-NA和A-NA中其他DEGs的FPKMs均低于低溫馴化樣品(即F-CA、A-CA和A-CA+UVB；圖6c)。雖然花青素在A-CA中沒有顯著積累(圖1e)，但C4H、FLS2、DFR、ANS、F3H、ANR、CHS1、CHS2和CHS3的轉錄水平(圖6c)高于A-CA+UVB或F-CA，說明低溫可以誘導花青素生物合成相關基因的表達，而花青素生物合成可能是一個轉錄后調控的過程。

花青素在細胞質中合成，然后通過谷胱甘肽S-轉移酶(GST)轉移到液泡中，GST催化花青素與谷胱甘肽結合。在本研究中，KO00480谷胱甘肽代謝途徑在試驗I和III中富集并伴隨花青素積累(圖1e，2c)。在試驗I和III中，分別有18和19個DEGs，其中分別有12個（都表達上調）和13個（其中8個表達上調）被注釋為GST。說明在花青素合成后谷胱甘肽代謝是一個重要的途徑。

（3）KO04712植物晝夜節律通路。該通路在試驗I、II和III中分別富集了8、6和8個DEGs，除了試驗III中的一個下調外，其余都上調。COP1-like、HY5和LHY的差異表達只存在于試驗I中（圖6d）。COP1在F-NA和A-NA中呈現不同的初始轉錄水平，并在試驗I、II和III中上調(圖6d)。COP1轉錄后影響HY5表達。HY5是堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族的轉錄因子，是多個光感受器的下游，該基因在轉錄上受光照或低溫的影響。HY5在試驗I中表達量顯著上調，而4℃處理后，在試驗II和III中沒有顯著變化(圖6d)，表明HY5的調控可能比以前報道的更復雜。LHY是MYB相關轉錄因子，被歸類為生物鐘的晨起基因。在本研究中，LHY在F-NA和A-NA中的初始表達水平顯著不同，試驗I中該基因表達上調，而在試驗II和III中表達差異不顯著(圖6d)。其他的DEGs被注釋為偽響應調節器(PRR)/類雙組分響應調節器或低溫相關查爾酮合成酶(CHS)，普遍存在于試驗I、II和III中(圖6d)。PRR與LHY在生物鐘中被歸為晨起基因，LHY的表達增強了PRR的表達。試驗II中晝夜節律通路的DEGs表明，低溫本身干擾了植物的晝夜節律。

?結論

研究者通過3個試驗來表征越冬常綠葉片低溫馴化的特征，并發現低溫前的光信號對于進一步增加耐凍性至關重要，因為某些信號轉導通路的激活可能會導致生長停止和低溫馴化。玉米黃質的積累是ABA生物合成的上游環節，可能在ABA水平中起關鍵作用。在本報告中，與營養生長的植物相比，ElsieLee的ABA可能在早秋通過對光信號的響應而積累，在冬季到來時下降。光信號和低溫均擾亂了ElsieLee的晝夜節律，轉錄因子HY5和LHY均參與其中。此外，F-CA和A-CA在激素信號轉導、光抑制/光保護程度、脂肪酸代謝和呼吸等方面的過程也有很大的不同，導致完成低溫馴化或未完成低溫馴化時的耐凍性不一致。UVB處理A-CAs表明，花青素在常綠葉片低溫馴化過程中與光保護的相關性大于增加耐凍性的相關性。