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標題：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM

發表雜志：EBioMedicine（IF=11.205）

發表時間：202209

研究背景

膠質母細胞瘤（GBM）是具有侵襲性的原發性腦腫瘤類型，通常對目前的治療具有耐藥性，以腫瘤微環境為中心的療法可能為GBM治療帶來新的希望。因此，迫切需要深入了解腫瘤-基質通訊，以確定有希望的治療靶點。

研究方案設計

1、收集人、小鼠GBM的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據、RNA-seq數據和空間轉錄組（Spatial transcriptomics，ST）數據；

2、免疫細胞分選

1）小鼠脾臟T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；

2）單核細胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨，40μm濾器過濾，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.；

3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。

3、流式分選：小鼠GBM細胞懸液抗體孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對照；

4、免疫熒光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。

5、細胞共培養：前神經元型膠質瘤細胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細胞，每三天加入新鮮的巨噬細胞，持續的刺激后檢測間充質表型的三種主要轉錄因子的表達（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。

數據分析方法

1、scRNA-seq數據處理：Seurat，低質量細胞過濾（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform標準化、PCA降維（npcs=30）、細胞類群識別FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；

2、ST數據處理：Seurat 4.0，SCTransform標準化、 PCA and UMAP降維聚類（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空間可視化；

3、腫瘤拷貝數據變異：inferCNV，過濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；

4、細胞軌跡分析：Monocle 2，過濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；

5、轉錄因子活性：SCIENCE，相關性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)

6、細胞通訊：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）

研究思路

研究結果

1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質性圖譜

利用Seurat整合分析了來自不同數據集的scRNA-seq數據（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共獲得來自40例患者的54,534個細胞（圖1a）；利用inferCNV分析進一步鑒別腫瘤細胞和正常細胞（圖1），與已發表的WES 數據一致；鑒定注釋到的惡性細胞包括：MES-like細胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like細胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like細胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like細胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非腫瘤細胞包括：巨噬細胞（8.2%，CD163、CD68）、小膠質細胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴細胞（0.7%，CD3D、NKG7）、內皮細胞（1.1%，VWF、PECAM1）、腫瘤相關內皮細胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突膠質細胞（4.3%，PTGDS、MBP）（圖1c-d）；GBM患者表現出高水平的瘤內異質性，尤其是腫瘤細胞（圖1E-F）；GSEA分析也驗證了GBM的不同腫瘤細胞亞型（圖1g）。

2、軌跡分析揭示前神經元-間充質亞型轉換中的關鍵轉錄調節因子

利用細胞軌跡分析，探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關系，結果顯示擬時間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細胞，同時有個小分支為AC-like腫瘤細胞，揭示了GBM的可塑性和前神經元型（proneural, PN）到間質型（mesenchymal, MES）的動態過渡（圖2a-c）；PN與細胞周期、G2M檢查點和神經膠質細胞分化相關的通路顯著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES與上皮-間充質轉化（EMT）、缺氧、ECM組織和細胞粘附相關的通路顯著富集（圖2d）；利用TCGA數據集進行生存分析，結果顯示，與PN組相比，具有MES-like轉錄組特征的患者總生存期較差，而與MES-low組相比，MES-high組預后更差，表明具有間充質特征的GBM患者的生存結局較差（圖2e）。Tips：利用TCGA數據庫中的臨床數據，將單細胞數據中鑒定到關鍵maker基因或基因集進行生存分析，是探討臨床意義的有效途徑。

利用SCENIC分析PN或MES細胞中的關鍵轉錄調控網絡，結果顯示，轉錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細胞中差異過表達，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細胞狀態中差異過表達，細胞軌跡分析證實了PN-MES轉換過程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調（圖2k）。以上結果突出了從PN到MES細胞狀態的動態轉變主要是由關鍵轉錄因子驅動的。

3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環境解析

利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組，發現MES-high組腫瘤微環境中伴有豐富的巨噬細胞、T細胞和內皮細胞浸潤（圖3a, b）；但T細胞浸潤在很多癌種的研究中與患者預后呈正相關，因此利用TCGA數據進一步分析，GBM MES亞型表達更高的T細胞和髓系細胞標志物，并且T細胞與巨噬細胞存在很強的相關性（圖3c-d）；對空間scRNA-seq數據進行分析，發現CD8 + T細胞與CD68 +髓系細胞、內皮細胞共定位（圖3e），證實了T細胞與髓系細胞之間存在空間上的緊密接觸，可能發生在血管微環境中（vascular niches）。Tips：每個實驗組增加ST樣本，不僅能與單細胞數據互相驗證，還能對maker基因和細胞類型進行空間定位，精準鎖定有真實空間物理接觸的細胞間互作關系。

利用反卷積算法對TCGA數據進一步進行分析，發現T細胞豐度與巨噬細胞、樹突狀細胞顯著相關，這是兩個主要的髓系細胞（圖3f）；利用流式細胞術，分析小鼠GBM中的免疫細胞，證實了T細胞與CD11b + F480 +腫瘤相關巨噬細胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC顯著正相關（圖3g）。因此，間充質亞型中T細胞比例較高主要是由于巨噬細胞的浸潤。

4、源自巨噬細胞的GPNMB有助于PN-MES細胞狀態轉變

利用NicheNet分析腫瘤微環境中的細胞間信號通訊，鑒定到了多個基質細胞-腫瘤細胞相互調控的配體-受體對，其中預測到巨噬細胞高表達的GPNMB與大多數間充質靶標存在相互作用（圖4a），GPNMB是一種跨膜糖蛋白，最初是在腫瘤細胞中發現的，參與腫瘤遷移、侵襲、轉移，通過直接抑制T細胞活化來逃避免疫；Tips：基于個性化分析結果，優先篩選TOP基因（顯著性、差異倍數、靶標基因數目等），結合研究領域內已有特定功能報道的基因或通路，可以幫助更快鎖定目標分子。

HPA和TCGA數據分析結果顯示，GPNMB主要在巨噬細胞中表達，并且與巨噬細胞標志物顯著正相關，這表明巨噬細胞是GPNMB的主要來源（圖4b, c），流式細胞術結果證實了GPNMB主要在巨噬細胞上表達，而不是樹突狀或腫瘤細胞。Tips：流式細胞術是單細胞測序常見的下游驗證方法，可用來分選目標細胞類群、驗證細胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細胞分選的可行性等。

GPNMB在MES亞型患者中高表達，并且與低級別和高級別膠質瘤的預后不良相關（圖4d, e）；推測高表達GPNMB的巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞向MES表型轉變，進一步利用細胞共培養系統來驗證這一假設，結果表明，長期接觸巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞中間充質轉錄因子的表達，并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用，表明GPNMB是PN-MES狀態過渡的重要調節因子（圖4f）。

5、小鼠scRNA-seq分析單核細胞分化為Gpnmb-high巨噬細胞

收集小鼠GBM scRNA-seq數據，重點關注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫細胞。根據細胞maker基因表達鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（圖5a）；與以往的報道類似，巨噬細胞隨著腫瘤進展急劇侵入腫瘤部位，而小膠質細胞在腫瘤發展過程中逐漸消失（圖5b）；細胞軌跡分析推斷出樹突狀細胞和巨噬細胞起源于單核細胞，并隨著腫瘤進展而逐漸分化（圖5c）；不同的通路主導了腫瘤浸潤T細胞的募集，單核細胞主要表達Cxcl10、Cxcl9、樹突狀細胞特異性表達Ccl17、Ccl22，而巨噬細胞表達Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細胞中出現(圖5d）；在腫瘤發生過程中，Arg1和Gpnmb的表達在巨噬細胞中被強烈誘導（圖5e-g），這與人GBM數據集中的發現一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（經典M2巨噬細胞標志物）表達不變，提示GPNMB不是M2巨噬細胞極化的驅動因素；免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細胞與T細胞共定位（圖5h），表明它們之間存在潛在的相互作用。

6、GPNMB-high巨噬細胞影響DC激活T細胞

利用CytoTalk算法分析GBM中T細胞與APC-like細胞間的相互作用，研究完整的信號轉導途徑，結果顯示，T細胞通過Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細胞、Gpnmb-high巨噬細胞、樹突狀細胞相互作用，并且DC細胞與Gpnmb-high巨噬細胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號與T細胞相互作用。為了驗證Gpnmb-high巨噬細胞的調控機制，從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細胞、D11c + DC和骨髓來源的單核細胞，然后與na?ve T細胞共培養（圖6e）；實驗結果顯示，與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比，CD11c + DC共培養表達更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地誘導T細胞活化（圖6f）；T細胞增殖實驗檢測結果也表明，與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比，CD11c + DC能顯著促進T細胞增殖（圖6g）。綜合以上結果，確定了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞亞群是GBM細胞間通訊的樞紐，不僅誘導PN-MES腫瘤細胞轉化，而且通過與DC競爭而損害T細胞激活。Tips：利用細胞通訊分析篩選潛在細胞間互作的受體-配體對，結合細胞共培養、co-IP和免疫熒光等實驗，可以探究目標細胞類型對特定細胞功能的影響及機制。

研究總結

1、本文通過scRNA-seq數據將高度異質性的GBM腫瘤細胞分為MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亞型；

2、利用細胞軌跡分析和轉錄調控網絡分析預測到由特定TF調節的PN到MES細胞狀態轉換；

3、利用空間轉錄組數據、TCGA數據庫、細胞通訊分析，鎖定到了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞，在PN-MES細胞狀態轉變中發揮重要作用；

4、通過信號轉導分析和細胞共培養研究，進一步揭示了這些源自單核細胞的GPNMB高巨噬細胞亞群可能無效地保留T細胞不被樹突狀細胞激活，提示未來靶向GPNMB-high巨噬細胞的聯合免疫治療可作為有潛力的治療策略。

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