百邁客是國內首批推出推出空間轉錄組測序服務（百邁客邀您體驗新技術——空間轉錄組），以及國內研發植物空間轉錄組測序技術（百邁客新品-植物空間轉錄組挑戰與機遇），突破了物種的限制性，還在FFPE樣本上實現了客戶古董珍貴樣本的空間轉錄組測序（百邁客 10x Visium FFPE 空間轉錄組預售正式啟動！），不僅拓展了空間轉錄組技術樣本適用范圍，也擴展了該技術在新領域的應用。
當然新技術的發展依賴于樣本的精細處理，特別是植物樣本處理和要求跟動物樣本要求有一些不同，百邁客經過十幾種物種、上百種組織類型的測試，積累了大量的樣本處理經驗，建立一套穩定組織樣本包埋方法，今天為各位老師獻上植物空間轉錄組實驗開展中樣本準備相關資料，讓您的實驗不再局限于取材階段，推動不同物種、不同組織類型在空間基因表達模式的檢測，提供單細胞空間多維度探索動植物生長發育、抗逆應激、免疫反應、生物進化等應用技術手段。
首先我們回顧一下在百邁客新品-植物空間轉錄組挑戰與機遇中提到的植物空間轉錄組實驗流程：新鮮組織取材-組織冷凍包埋-冷凍切片-甲苯胺藍染色-組織優化-建庫測序-數據分析，因為植物組織結構上跟動物組織存在很大差異性，在前期樣本準備取材工作就顯得尤為重要，接下來我們就植物組織樣本準備和冷凍包埋過程做一個總結：
樣品處理和包埋注意事項
(1) 客戶在制備樣本時，需要準備8-10個包埋塊/樣（質檢、切片厚度調整、捕獲區域確定）：一份用于常規RNA提取，以確保樣本自身及樣本制備不存在問題，當RNA RIN>7.0時，可進行后續實驗；另外部分用于正常的切片厚度調整(10-50μm)和捕獲區域確定以及正式實驗；
(2) 目前Visium芯片捕獲區域大小為6.6×6.5mm2, 因此對組織包埋塊的大小有一定要求（≤6.5mm3） ,較小的組織可建議多個組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面，厚度滿足1mm以上即可
話不多說，直接獻上百邁客植物空間轉錄組液氮異戊烷冷凍OCT包埋標準樣本制備詳細步驟攻略，我們先睹為快！
插入視頻：
相信看完了視頻，大家對組織變成白色的OCT包埋塊有了清晰的認識，那這個過程發生了哪些反應呢？小編這里給大家一一講解此次夢幻傳奇之旅：
傳奇穿越之旅-裝備攻略
首先需要準備此次穿越之旅必備裝備，才能穿過重重阻撓，實現組織到包埋塊到切片的華麗蛻變。武器裝備材料如下：
1. OCT包埋劑（一級裝備）：美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規格：118 mL/瓶，獲取途徑，各種武器店供應商有現貨，百元大洋左右，必不可缺，一瓶就可以完成上百次穿越旅行；
2. 包埋盒（一級裝備）：冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm，物廉價美，某寶上只要20元左右就可獲取百件同等級別裝備；
3. 異戊烷（一級裝備）：CAS號78-78-4，規格500 mL，可直接購買，但裝備易燃，請小心使用；
4. 液氮、1xPBS、鑷子、剪刀、冰塊、培養皿（二級裝備）、吸水紙：可購買或自行配置。
圖1：裝備攻略示意圖
在無菌超凈臺中，用異戊烷（足以完全浸沒組織包埋盒）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5-10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結。
將包埋盒（冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm）放置在冰上，標記包埋盒（組織放置的方向、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑（美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規格：118 mL/瓶），約1/4深度，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部；
圖2 包埋劑、沖洗液、包埋盒、異戊烷預處理示意圖
FAQ 1: 植物組織必須要進行液氮異戊烷凍存嗎，能否用其它方法替代？
答：目前植物細胞具有細胞壁和液泡，細胞中存在大量水分更容易在低溫冷凍過程中形成冰晶，損傷植物組織細胞的結構形態，而且冷凍后植物樣品比動物樣品硬度大，難以切片和保持植物組織結構的完整性。常用方法直接包埋法、液氮速凍法【1】以及繁瑣的FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定都無法快速得到較好的植物組織冷凍切片效果，這里推薦了液氮異戊烷冷凍-OCT包埋法（百邁客已經完成近1000個樣本測試），液氮可以快速冷凍，組織在異戊烷中未直接接觸液氮既可以防止RNA降解，還避免形成晶體，防止組織形態受損。如果組織類型硬度較大或者木質化程度較高或者組織器官存在很多空隙樣本，可以推薦蔗糖溶液作為冷凍保護液，將植物組織放在合適濃度蔗糖溶液中固定，用對應濃度的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，最后抽真空的方法可較大達到包埋切片效果。
FAQ 2: 植物組織包埋劑選擇，是否必須使用OCT包埋劑？
答：目前空間轉錄組推薦使用標準包埋劑就是OCT（櫻花牌，SAKURA ，4583），必須使用，已經在Stefania[2][3]方法中得到驗證，在植物器官組織表面涂抹一層OCT組織包埋劑（水溶性乙二醇和樹脂組成）可以較好保存組織切片的完整形態，其優點在前期提到過：
1）保留組織結構并在冷凍切片過程中提供結構支撐；
2）在切片過程中保持最*溫度，從而使切片光滑；
3）由于其水溶性，可與多種染色程序兼容。通過櫻花牌OCT包埋劑可以達到植物空間轉錄組測序樣本制備的要求。
FAQ 3：所有的試劑、包埋盒是否都需要在冰上操作？
答：是需要，為了降低植物組織RNA降解的可能，需要對相應的器具、試劑放在4℃環境中預冷，也就是前期一些工作需要在冰上操作完成，盡可能減少組織RNA的降解。
傳奇穿越之旅-取材攻略
從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5mm3大小（大小要適宜，現階段芯片大小為6.5×6.5mm2，一般組織覆蓋率達到芯片25%以上，低于25%建議多個包埋），利用預冷的蒸餾水將組織沖洗三次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液。
圖3 植物空間轉錄組組織樣本取材預處理示意圖
FAQ 4：可否使用其他植物組織緩沖液？
答：本方法推薦蒸餾水作為植物組織表面清洗緩沖液，不建議直接用1xPBS作為植物組織表面清洗緩沖液，為了維持組織形態結構原始穩定性，高濃度PBS會導致植物組織細胞容易收縮變形，選擇蒸餾水可以簡單快速清洗干凈表面污漬。如果采用蔗糖溶液作為冷凍保護液，可以采取相應濃度蔗糖（1x PBS配置）做為植物清洗緩沖液。
FAQ 5：植物組織太小該如何包埋才能最大限度利用芯片覆蓋度？
答：為了保證最大限度利用芯片覆蓋度，解決組織樣本太小情況，這里推薦多個組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面，如上圖所示。另外一定要備注清楚方向和每個樣本形態結構，后續數據分析，需要清楚知道對應樣本切片位置，此時應該清楚備注每個樣本方向和位置信息。
傳奇穿越之旅-冷凍包埋
在冰上操作，用鑷子輕輕夾住組織，緩慢加入預冷的OCT包埋劑，直至OCT完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置，保證目標平面與切面水平一致，尤其是多個組織包埋一定要排列整齊，避免重疊在一起，此過程中避免產生氣泡，如有氣泡產生用用針尖輕緩挑出氣泡。
圖4 植物空間轉錄組組織OCT包埋示意圖
圖5 植物組織塊在包埋盒中示意圖
選擇最小規格包埋盒（7*7*5mm），組織塊合適大小（6.5mm3）
用鑷子夾緊包埋盒，使異戊烷沒過其底部但不淹沒整個包埋盒，不要使異戊烷浸入包埋盒內（組織不直接接觸異戊烷），當OCT由透明轉變為完全不透明的白色塊狀時，組織基本完全凍結，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存（在室溫下，異戊烷溫度會迅速升高，冷凍過程中一旦異戊烷升溫，需要馬上置于液氮中重新冷卻）或直接進行切片。冷凍時間可根據組織類型和大小而變化。
圖6 植物組織塊液氮異戊烷冷凍示意圖
圖7 植物組織塊根、莖、胚芽鞘、花苞、芽等組織液氮異戊烷冷凍OCT包埋塊示意圖
傳奇穿越之旅-密封運輸
將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用錫箔紙包裹整個包埋盒或者扣下包埋塊將包埋塊放入50 mL離心管密封處理），并做好樣本信息標記，利用干冰運輸。
圖8 植物組織OCT包埋塊密封處理示意圖
FAQ：這種液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織可以-80℃存放多久？
答：2個月。理論上密封處理后可以-80℃長期保存，與動物組織不同，植物組織脆弱性和結構特異性，液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織在-80℃可以儲存2個月左右，就要進行切片實驗和后續實驗，不然也會影響切片效果和RNA降解。
本期【空間轉錄組】植物組織到冷凍切片的傳奇穿越之旅基本上到此就告一段落，后需會繼續為大家奉上第二部傳奇之旅，詳細說明植物組織冷凍切片如何實現空間位置基因表達信息的穿越，這其中又有經過多少難關才能實現我們的最終穿越。欲知更多百邁客植物空間轉錄組后續實驗和實測數據分析，盡在下期分享，敬請期待。
百邁客空間轉錄項目經驗
圖9. 百邁客空間轉錄組動物冷凍組織切片HE染色
圖10. 百邁客空間轉錄組植物冷凍組織切片甲苯胺藍染色
百邁客空間轉錄組優勢
◆多物種：人、鼠、哺乳動物、植物等多物種均可開展空間轉錄組檢測服務
◆多樣本類型：冷凍組織、FFPE組織多種組織類型都可以實現空間轉錄組測序
◆ 設備全：擁有冷凍切片機、石蠟切片機、多系統熒光顯微鏡，可滿足多樣本空間轉錄組高通量測序，一次性多通道、多樣本，實現高效空間轉錄組測序服務；
◆ 經驗豐富：國內首批引進10x visium 空間轉錄組測序平臺，目前累計成功制備50余種組織類型、1000+例的空間轉錄組樣本
◆強大生信分析：可提供基本分析和高階分析，滿足個性化調整
◆全套服務：組織樣本切片、固定、透化、建庫、測序、數據分析全套服務
◆單細胞和空間云分析平臺：百邁客云平臺已經研發快速高效的云平臺，可高效呈現高質量文章圖表和對大數據進行挖掘；
◆空間轉錄組&單細胞聯合分析：空間轉錄組多組學聯合分析，可近似實現單細胞分辨率空間轉錄組基因表達特征，交互式分析。
百邁客年末促銷，鉅惠來襲
活動1：單細胞X平臺驚爆價：17000元起/樣，5臺華為筆記本免費送（價值5600元） ；
活動2：單細胞轉錄組活動價：建庫測序分析項目買5送1，建庫測序項目享9折并送百邁客云分析賬號（價值2000元）；
活動3：單細胞免疫組庫特惠價：TCR/BCR免費送，單細胞轉錄組免費升級到單細胞免疫組；
活動4：空間轉錄組心動價：建庫測序分析項目買3送1，建庫測序項目享9折并送百邁客云分析賬號（價值2000元）；FFPE樣本建庫測序項目享8.8折并送百邁客云分析賬號（價值2000元）
活動5：單細胞系列簽單福利：單細胞生信培訓班免費送（價值2400元）、峰會單細胞會場直播回放視頻免費送
參考文獻：
[1]陸振芳, 蔣素華, 江敏,等. 蝴蝶蘭花器官冰凍切片技術探討[J]. 河南農業大學學報, 2019, 053(002):200-206.
[2] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.
[3] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
推薦閱讀
Nature Protocols | 風口浪尖-抓住空間轉錄組技術的機遇
空間轉錄組樣本制備二：BMK實驗篇
【空間轉錄組】樣本制備（一）
單細胞轉錄組助力構建不同胃腺癌亞型的轉錄組圖譜
空間轉錄組-在生長發育中的應用2
空間轉錄組-在癌癥中的應用1
京公網安備 11011302003368號