中文名:闡明種子傳播的E.gansuensis內生真菌增加醉馬草對NaCl脅迫的耐受性分子機制

英文名:Elucidating the Molecular Mechanisms by which Seed-Borne Endophytic Fungi, Epichlo? gansuensis, Increases the Tolerance of Achnatherum inebrians to NaCl Stress

雜志：IntJMolSci

影響因子：4.556

研究背景

A.inebrians與種子傳播的內生真菌Epichlo?gansuensis形成共生關系，這是其對生物和非生物脅迫的適應性和生產力的重要因素。這種共生為A.inebrians提供了幾個優勢，包括抗鹽和抗旱性，提高水和氮的利用效率并增加生物量。此外，它還提高了氮代謝的酶活性，耐鎘，清除活性氧和抗病蟲害的能力。植物與Epichlo?內生菌的共生可能調節生長之間的權衡和寄主草對非生物脅迫的抗性。這可能是兩者相互作用的結果，Epichlo?增強寄主草對非生物脅迫的耐受性并促進植物生長。與非共生植物相比，共生植物通常表現出更多的分蘗和生物量。Epichlo?gansuensis與Achnatheruminebrians形成穩定的關聯，是研究本地草和真菌內生菌相互作用的理想宿主。

研究目的

高通量測序是一種有效的方法用轉錄本來探索原生草對非生物脅迫的反應，即使沒有參考基因組序列。以前的研究表明，許多差異表達寄主草的基因受Epichlo?內生菌的影響。在目前的研究中，我們探索了A.inebrians的全長轉錄本信息，評估了其作用在200mMNaCl脅迫下E.gansuensis感染對A.inebrians生長的影響并通過Illumina測序在A.inebrians的葉子中確定參與轉錄本對醉馬草產生反應的基因。研究旨在探索內生真菌E.gansuensis感染后NaCl脅迫下宿主草的轉錄組，并提供E.gansuensis增加NaCl的寄主草耐受性的分子機制見解。

材料方法

12Epichlo?gansuensi感染（E+植物）和未感染的種子（E-植物）A.inebrians播種在16個盆中，種子發芽一周后，每個花盆每周澆150mL1/2Hoagland，同時每個花盆每周澆200毫升蒸餾水。6周后，4個E+苗盆和4個E-苗盆用150mL的1/2Hoagland和0mMNaCl澆灌，4個E+幼苗花盆和4個E-苗盆用150mL的1/2Hoagland與200毫升氯化鈉處理4周；同時對4個E+苗盆和4個E-苗盆每周200mL蒸餾水處理，4個E+苗盆和4個E-苗盆每周用200mL蒸餾水和200mMNaCl。4周后取0mM和200mMNaCl濃度下的E-植物（葉和根混合）的總RNA根據制造商的方案，通過植物RNA提取試劑盒并用DNaseI消化以去除基因組DNA，用PacBio測序全長轉錄組。此外，共有12個RNA樣本來自在0mMNaCl和提取200mMNaCl以通過Illumina測序。提取的RNA檢測和定量使用安捷倫生物分析儀2100和Nanodrop2000。

研究結果

1、基于SMRT的RNA測序

采用PacBio測序平臺進行單分子實時（SMRT）測序，獲得芨芨草全長轉錄組信息。從單個E-植物中收集葉子和根，徹底混合并用于mRNA提取。構建了全長cDNA文庫，隨后用SMRT測序（補充圖S1A）。我們獲得了940,319個ROI（總堿基：1,789,709,871），其中包括6.41%的全長嵌合序列和78.55%全長非嵌合序列（補充圖S1B和表S1）。此外，738,588個全長非嵌合序列、60,317個全長嵌合序列和68,878個轉錄本，轉錄本的平均讀取長度為1832bp。

2、ORF和SSR的預測

E?A.inebrians總共預測了34,764個開放閱讀框(ORF)和27,202個完整的ORF。長度分布表明長度為800~1200的ORF為5,926個（補充圖S2）。在大多數生物體中，簡單序列重復（SSR）是一個重要的分子標記，我們的結果表明E?A.inebrians檢測到15,945個的SSR，其中大多數具有單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復和四核苷酸重復（補充表S2）。由于SMRT測序序列的高組裝質量，SSR的信息可用于E?A.inebrians未來的遺傳分析和標記輔助育種。

3、轉錄本的功能注釋和轉錄因子的分類

總體而言，94.16%的A.inebrians轉錄本在選定的數據庫中進行了注釋，并且單個數據庫的成功率在41.54%到93.83%之間。GO，KEGG，COG，KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和NR注釋率分別為82.05%、41.54%、42.07%、57.65%、79.78%、68.45%、92.44%和93.83%（補充表S3）。這些結果表明，大多數基因是真正轉錄的序列，而且很可能A.inebrians中的功能基因。此外，我們獲得了63個轉錄基因家族因子（TF）并確定了1536個A.inebrians的推定TF成員（補充表S4)。此外，MYB相關TF、bHLHTF、NACTF和bZIPTF占大比例（補充圖S3）。

4、E.Gansuensis在各種NaCl濃度下改變了A.Inebrians的轉錄本

進一步闡明E.gansuensis在NaCl脅迫下對寄主植物生長的分子機制，E+和E-A.inebrians葉片（28天齡）的轉錄組通過Illumina測序進行分析。E+A.inebrians和E-A.inebrians用含0mMNaCl和200mMNaCl濃度處理。閾值FDR≤0.01和FC≥2用于確定DEG（差異表達基因）。結果顯示響應E.gansuensis的轉錄本發生顯著變化，在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下的分別發生2464和1817DEGs（圖1）。此外，在NaCl脅迫下，轉錄本發生了顯著變化，E+葉子的4919個DEG。然而，一個小的轉錄組變化發生在對NaCl脅迫的響應，E-葉為502DEG（圖1）。

5、E.Gansuensis調節A.Inebrians的不同生物過程以維持生長與抗NaCl脅迫之間的平衡

E.gansuensis上調1269個基因，下調1195個0LE+基因（葉E+植物在0mMNaCl下）與0LE-（E-植物在0mMNaCl下的葉子）相比。類似地，E.gansuensis誘導844個基因并抑制200LE+（E+植物的葉子）的973個基因在200mMNaCl下）與200LE-（E-植物的葉子在200mMNaCl下）相比（圖1）。目前的結果表明在NaCl脅迫下E.gansuensis對基因的調控有巨大的影響與200mMNaCl相比。對0LE+和0LE-之間的DEGs進行GO富集分析發現，E.gansuensis主要誘導“鈉離子跨膜轉運”、“胚胎后發育的正調控”、“蛋白質磷酸化”、“光系統化學計量調整”和“谷氨酸代謝過程”（圖2A）。此外，GO富集分析表明，類別“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“類黃酮生物合成過程”、“氧化-還原”過程”和“陰離子跨膜轉運”在下調中富集E.gansuensis在0mMNaCl濃度下的DEGs（圖2B）。這些結果暗示E.gansuensis重新編排了植物生理學和重要生物學的許多方面提高寄主植物的競爭力。GO富集分析在200LE+和200LE?之間的DEGs表明，E.gansuensis主要誘導“蛋白質磷酸化”、“氧化還原過程”、“油菜素類固醇生物合成過程”、“細胞鈣離子穩態”和“L-谷氨酸轉運”（圖2C）；此外，GO富集分析發現“蛋白質磷酸化”的類別，“果糖6-磷酸代謝過程”、“類黃酮生物合成過程”和“MAPK”在200mMNaCl濃度下，E.gansuensis在下調的DEG中富集級聯”（圖2D）。我們的研究結果表明，E.gansuensis通過激活細胞信號轉導促進宿主在脅迫環境下的生長，維持平衡。促進ROS、Ca2+信號和油菜素類固醇(BR)的生物合成，它們在抗壓過程中起作用。

6、E.Gansuensis在A.Inebrians兩種氯化鈉濃度中轉錄本重排中起的獨特作用

Venn結果顯示E.gansuensis僅上調1135DEG在0mMNaCl濃度下的LE+和LE-之間，E.gansuensis在200mMNaCl脅迫下僅上調LE+和LE-之間的710DEG；此外，134DEG的LE+與LE-在E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl（補充圖S4A）。同樣，E.gansuensis在0mMNaCl和E.gansuensis僅下調LE+和LE-之間的928DEG僅在A.inebrians中下調LE+和LE-之間的706DEG作為響應至200mMNaCl（補充圖S4B）。分析結果表明這些特殊的上調或下調的LE+與LE-的DEG的GO富集0mMNaCl和200mMNaCl分別顯示磷酸化信號，次生代謝物的合成和轉運，以及離子跨膜轉運A.inebrians主要富集于E.gansuensis獨特的上調DEGs在0mMNaCl濃度下（圖4A）。GO富集分析結果表明A.inebrians的“蛋白質磷酸化”、“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉運”、“果糖6-磷酸代謝過程”、“類黃酮生物合成過程”和“磷酸化信號轉導”主要在200mM甘肅E.gansuensis獨特的上調DEG中富集NaCl濃度(圖4C)。細胞信號轉導通路（“蛋白磷酸化”和“細胞表面受體信號通路”）、“類黃酮生物合成A.inebrians的“過程”、“細胞表面受體信號通路”、“葡萄糖輸入”、“陰離子跨膜轉運”和“細胞分裂”主要富集于E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下共享上調的DEG（圖4B）。E.gansuensis主要僅抑制“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“葡萄糖輸入”、“長鏈脂肪酸代謝過程”、“黃酮類生物合成過程”、“陰離子跨膜轉運”和“氧化還原過程”的A.inebrians，主要在獨特的下調DEG中富集由E.gansuensis在0mMNaCl濃度下（圖4D）。“蛋白質磷酸化”、“果糖6-磷酸代謝過程”、“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“通過果糖-6-磷酸進行糖酵解過程”，“類黃酮生物合成過程”，“調節蛋白磷酸酶2A型活性”，“鉀離子跨膜”A.inebrians的運輸”和“MAPK級聯”主要富集于獨特的甘肅大腸桿菌在200mMNaCl濃度下下調DEG（圖4F）。細胞信號轉導（“蛋白質磷酸化”和“細胞表面受體信號通路”）、次生代謝產物（“類黃酮”生物合成過程”、“絲氨酸家族氨基酸生物合成過程”和“細胞氨基酸代謝過程”）和“過氧化氫分解代謝過程”A.inebrians主要在0mMNaCl和200mMNaCl的E.gansuensis共享的下調DEG中富集（圖4E）。

7、NaCl脅迫對A.InebriansE+和E—植物中轉錄本重排的獨特影響

NaCl脅迫僅上調LE+和LE+之間的2015DEG，且僅NaCl脅迫在LE-和LE-之間上調139DEG（補充圖S4C）。氯化鈉脅迫僅在LE+和LE+之間下調4707DEG，NaCl脅迫僅下調LE-和LE-之間的290DEG（補充圖S4D）。分析結果這些特殊上調的DEG在0mMNaCl與200mMNaCl下的GO富集度LE+和LE-分別表明NaCl脅迫主要調節氧化還原過程、次生代謝物的生物合成、小分子轉運和細胞信號轉導，主要富集在LE+和LE-中獨特的上調DEGs（圖5A，C）。例如“氨基酸跨膜轉運”、“類黃酮生物合成過程”、“鉀離子跨膜轉運”、“葡萄糖輸入”、“L-α-氨基酸跨膜轉運”、“陰離子跨膜轉運”、“信號轉導”A.inebrians的磷酸化”、“MAPK級聯”、“氧化還原過程”和“過氧化氫分解代謝過程”主要富集于獨特的上調氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5C）。次生物質的代謝和運輸代謝物（“一元10羧酸代謝過程”、“蛋白質分解代謝過程”和“脂質代謝過程”），ROS信號（“過氧化氫分解代謝過程”和“細胞對過氧化氫的反應”）和A.inbrians的“蛋白質磷酸化”主要富集分別在LE+和LE-之間的NaCl脅迫下共享上調的DEG（圖5B）。類似地，“蛋白質磷酸化”、“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“類黃酮生物合成過程”、“氨基酸跨膜轉運”、“鉀離子跨膜”轉運”、“鈣離子跨膜轉運”和“谷氨酸代謝過程”A.inebrians主要富集在NaCl下LE+中獨特的下調DEGs壓力（圖5D）。次生代謝物的合成和轉運（“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉運”、“類黃酮生物合成過程”和“長鏈脂肪酸代謝過程”）、“鉀離子跨膜轉運”、“氧化-還原過程”和信號轉導途徑（“磷酸化信號轉導”A.inebrians的“MAPKcascade”）主要富集于獨特的下調氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5F）。次生物質的代謝和運輸代謝物（“氨基酸跨膜轉運”、“脂質代謝過程”、“氨基酸進口”、“糖酵解過程”和“一元羧酸代謝過程”）、“陰離子跨膜轉運”、“氧化還原過程”和“陰離子穩態”。主要富集于LE+和NaCl脅迫下共享的下調DEGsLE-(圖5E)

8、E.gansuensis在NaCl脅迫下對A.Inebrians轉錄因子表達模式的影響

E.gansuensis在0mMNaCl下調節A.inebrians的16個轉錄因子(TFs)濃度，有10個上調的TF和10個下調的TF；上調的TF包括MYB相關、bHLH、CAMTA、B3-ARF、C2H2、GARP-G2樣、MADS-M型和1個TrihelixTF（補充圖S5A），其中MYB相關的TF最多與0mMNaCl的其他TF相比，對內生真菌敏感。下調的TF包括GRAS、CPP、HSF、AP2/ERF-ERF、C2C2-LSD、NAC、C3H、bHLH、bZIP和MYB相關的TF（補充圖S5A）。E.gansuensis影響了A.inebrians的14個TFs200mMNaCl濃度，有5個1112上調的TF和12個下調的TF；這上調的TF，包括HB-HD-ZIP、MYB、NAC、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2H2、C3H、GARP-G2-like、GRAS、HSF、WRKYTFs和NACTFs受到顯著影響通過200mMNaCl脅迫下的內生菌（補充圖S5B）；下調TF包括3個B3-ARF、1個HB-BELL、1個HB-HD-ZIP、2個MYB和1個NACTF（補充圖S5B）。此外，NaCl脅迫調節了LE+中A.inebrians的30個TF，具有23個上調的TF和17個下調的TF；上調的TF包括AP2/ERFAP2、C2C2-CO-like、C2C2-Dof、C2C2-LSD、CPP、FAR1、GARP-G2-like、GRAS、HB-BELL、NF-YC、RWP-RK、WRKY、zf-HD、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、HSF、LOB、MYB相關和NACTF（補充圖S5C）。下調的TF包括AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、2HSF、LOB、MYB相關，NAC、B3、B3-ARF、BES1、HB-HD-ZIP、MYB、Tify和Trihelix，與MYB相關，NAC和WRYKTFs在LE+中受到NaCl脅迫的顯著影響（補充圖S5C)。NaCl脅迫調節LE+中A.inebrians的7個TF，其中2個上調TFs和5個下調的TFs；上調的TF包括兩個WRKY和一個NF-YCTFs，而下調的TFs包括bZIP、GARP-G2-like、HSF、三種MYB相關和一個NF-YATF（補充圖S5D）。

9、E.Gansuensis改變與類黃酮生物合成相關的關鍵基因的表達、光合作用、植物激素信號轉導和氨基酸代謝在氯化鈉壓力下

E.gansuensis顯著激活10個基因和5個光合作用基因分別為0mM和200mMNaCl濃度下。E.gansuensis的作用寄主植物的光合作用基因更明顯在0mMNaCl下比200mM氯化鈉（圖6A）。此外，E.gansuensis顯著激活植物的五個信號傳導基因在0mMNaCl濃度下；這些基因包括乙烯信號通路的兩個基因、生長素信號通路的兩個基因和脫落酸信號通路的一種基因。然而，E.gansuensis沒有顯著激活植物激素信號轉導基因在200mMNaCl濃度13下(圖6B),這意味著NaCl的影響大于E.gansuensis在植物激素基因表達方面的研究。E.gansuensis顯著下激活植物激素信號轉導基因在0mMNaCl濃度下，但E.gansuensis在200mMNaCl濃度下顯著調控兩個類黃酮生物合成基因(圖6C)。E.gansuensis顯著抑制氨基的八個基因在0mMNaCl濃度和E.gansuensis的酸代謝顯著激活下激活植物激素信號轉導基因在200mMNaCl濃度下的（圖6D）。更遠，E.gansuensis顯著下調甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，以及作為色氨酸代謝在0mMNaCl濃度下。E.gansuensis顯著下調賴氨酸降解，上調精氨酸和脯氨酸代謝在200mMNaCl下。因此，很可能，E.gansuensis通過調節宿主氨基酸代謝來提高A.inebrians的耐鹽性。

文章亮點

本文通過全長轉錄組結合二代轉錄組分析，研究了在NaCl脅迫下，E.gansuensis對宿主A.inebrians的重排生物學過程產生重大影響以適應各種NaCl濃度。結果表明內生真菌重塑宿主的基因表達以適應高鹽環境，探索了E.gansuensis提高寄主草對NaCl脅迫的耐受性的分子機制，PacBio測序獲得的轉錄本數據主要促進了A.inebrians基因注釋，進一步推動了基因研究功能。研究證明了內生真菌增加宿主對鹽脅迫的耐受性分子機制，為內生菌制造耐鹽草料分子育種提供理論依據。14