微生物多樣性測序是對環(huán)境樣品中細菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA進行特定長度的PCR擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序的分析，可實現(xiàn)對環(huán)境樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種和一些未知物種進行檢測，精準解析微生物在種屬水平上的組成和豐度情況，是當前研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術手段。

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中文題目：海洋厭氧氨氧化菌在不同磷酸鹽劑量下處理含氮鹽水廢水的脫氮機理：微生物群落轉(zhuǎn)變和磷酸鹽結(jié)晶

期刊：Bioresource Technology

影響因子：9.642

發(fā)表時間：2021.04

合作單位：青島大學

研究方法：16S rDNA測序（百邁客提供）+動力學分析

摘要

2021年4月，青島大學在《Bioresource Technology》發(fā)表題為“Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal”的研究論文，該論文主要研究了（1）不同磷酸鹽劑量下MAB（marine anammox bacteria，海洋厭氧菌）的脫氮機制；（2）微生物群落變化；（3）磷酸鹽沉淀的組成和特征。

文章首先從磷酸鹽對含氮鹽水廢水中MAB主導的厭氧氨氧化過程的影響出發(fā)，發(fā)現(xiàn)MAB的活性通過加入低濃度磷酸鹽增強（5-30 mg/L PO43–P），并且完全去除銨的時間縮短了0.5小時。當PO43–P超過160mg/L時，反應器內(nèi)形成磷酸鈣鎂沉淀，底物與生物量的接觸受到沉積物的阻礙，MAB的脫氮性能也變差。當PO43?-P到達400 mg/L，氨氮去除率和亞硝酸鹽去除率分別降低至0.45和0.43 kg/(m3·d)。實驗的158天里，MAB始終是優(yōu)勢菌株，但其相對豐度在400 mg/L PO43–P 時下降了15.4%。此外，沉積物的存在刺激了胞外聚合物的產(chǎn)生，當PO43–P 的濃度為200 mg/L時，胞外聚合物的最大產(chǎn)量達到 11.25 mg/g·濕重。

研究背景

厭氧氨氧化（anammox）作為一種新型脫氮工藝，具有節(jié)能、無二次污染等優(yōu)點，在污水處理領域具有廣闊的應用前景。厭氧氨氧化細菌可分為淡水氨氧化細菌（FAB）和海洋氨氧化細菌（MAB），MAB對鹽分有很大的耐受性，在處理含氮含鹽廢水方面具有巨大的潛力。來自一些沿海工廠（例如水產(chǎn)養(yǎng)殖）的污水含有高濃度的鹽和磷酸鹽，尤其是養(yǎng)殖廢水中還含有大量的氨和亞硝酸鹽氮，排放到環(huán)境水體中會引發(fā)富營養(yǎng)化，城市污水處理廠一般在厭氧氨氧化工藝后進行磷回收，因此，殘留的磷會通過污泥回流流入?yún)捬醢毖趸兀绊憛捬醢毖趸阅堋５P于無機磷酸鹽多厭氧氨氧化微生物的影響還不明確，以及磷酸鹽對含氮含鹽廢水中MAB（即Candidatus Scalindua）脫氮的影響尚未清晰。

研究方法

反應器：雙層序批式反應器（SBR，double-layer sequencing batch reactor），材料為聚甲基丙烯酸甲酯，工作容量為7L，流入體積與反應器體積的交換體積比為5/7。

污水制備：青島膠州灣海水（35‰鹽度和19‰氯度）

檢測內(nèi)容：
①反應器內(nèi)部溫度，②進出水口NH4+-N、NO2–N、NO3–N和PO43–P，③胞外聚合物（EPS），④反應器內(nèi)的沉淀物質(zhì)，⑤反應器0（S0）、84（S1）、158天（S2）時生物膜上的樣品進行16S rRNA測序（百邁客提供）

實驗流程：

圖1.實驗流程圖

主要研究結(jié)果

1 在不同磷酸鹽劑量下MAB脫氮效果

在整個實驗過程中，通過固定進水底物濃度和水力停留時間，保持進水負載率恒定，研究了磷酸鹽在158天內(nèi)對MAB脫氮性能的影響。結(jié)果如圖2所示，出水NH4+-N和NO2–N在30天時幾乎完全被去除（圖2a），隨著磷酸鹽濃度增加，出水NO2–N濃度略有增加。當PO43–P達到120 mg/L時，出水NH4+-N增加，NO2–N超過20 mg/L。當PO43–P濃度增加到160-400mg/L時，出水NH4+-N隨著進水磷酸鹽的增加而顯著增加，最終穩(wěn)定在76.56mg/L，同時出水NO2–N的濃度增加到了131.29mg/L，NO3–N減少到24.82mg/L。

在PO43–P≤80 mg/L時，氨氮去除率（ARE）和亞硝酸鹽去除率（NRE）均保持在90%以上，氨氮去除速率（ARR）和亞硝酸鹽去除速率（NRR）分別為0.91和1.18 kg /(m3·d)（圖2b、c）。當進水PO43–P為160–400 mg/L時，ARR 和 NRR 分別從0.72和0.90下降到0.45和0.43 kg/(m3·d)，ARE和NRE最終分別下降到50%和35.17%。此外，ΔpH（出水pH-進水pH）值開始急劇下降并在0.2上下波動，間接反映了厭氧氨氧化性能的惡化。從化學計量比也可以得出上述結(jié)果，在300-400濃度下，化學劑量比都偏離了理論值（1.32和0.26）（圖2e）， ΔNO2–N/ΔNH4+-N和ΔNO3–N/ΔNH4+-N的值分別下降到0.96和0.20。84天時，在SBR中首次發(fā)現(xiàn)了白色沉淀物，并隨著進水磷酸鹽用量的進一步增加而積累。沉積物的XRD（X射線衍射）圖顯示為磷酸鈣鎂（Ca7Mg2P6O24）。

出現(xiàn)高濃度磷酸鹽抑制MBA脫氮的原因可能是厭氧氨氧化生物膜對磷酸鹽比顆粒污泥更敏感，或者磷酸鹽沉淀的存在干擾了微生物與底物之間的接觸（主要原因）。此外，SBR運行后，出水NH4+-N和NO2–N被完全去除，這說明磷酸鹽沉淀物對MAB無毒害作用。

圖2. 不同磷酸鹽劑量下MAB在158 d內(nèi)的脫氮性能：(a)底物濃度；(b)去除效率；(c)裝載率；(d) pH值變化；(e)化學計量比

2 不同磷酸鹽劑量下MAB的脫氮特性

如圖3所示，當磷酸鹽濃度為0-80 mg/L時，出水NH4+-N幾乎完全被去除，NO2–N≤11 mg/L。其中在5-30 mg/LPO43–P期間，去除銨態(tài)氮的時間從4h減少到3.5h，同時，出水NO3–N在PO43–P為30 mg/L達到最大值。因此，低劑量的磷酸鹽滿足了MAB的生長需求并增強了其活性。在50-120 mg/L時，完全去除NH4+-N的時間回到了4 h，可能原因：升高的磷酸鹽與厭氧氨氧化酶和底物形成的化合物結(jié)合，導致酶活性降低和反應速度變慢，在160–400 mg/L PO43–P時，MAB的脫氮受到嚴重影響，但在300-400 mg/L PO43–P階段，NH4+-N轉(zhuǎn)化率高于200 mg/L的階段，因為其出水濃度并沒有顯著增加（圖3a），NO2–N和NO3–N則依舊隨著磷酸鹽濃度增加而出水濃度增加，這可能是由于NH4+的吸附。

微生物細胞和EPS由于其負電荷可以吸附陽離子，并在20分鐘內(nèi)達到吸附平衡，運行周期前0.5小時NH4+-N的急劇下降與該結(jié)論一致。一般來說，游離金屬離子的存在會抑制NH4+的吸附。然而，由于形成磷酸鈣鎂沉淀，消耗了Ca2+和Mg2+，增強了NH4+的吸附。300-400 mg/L PO43–P時，根據(jù)磷酸鹽濃度和出水NH4+濃度成正比計算得到理論去除值為65.92和56.85 mg/L，而實際值為83.97和79.79 mg/L，由此計算，相應的吸附百分比分別為21.5%和28.8%。

如圖3d所示，ΔNO2–N/ΔNH4+-N 和ΔNO3–N/ΔNH4+-N在前2小時出現(xiàn)不規(guī)則波動，然后趨于穩(wěn)定。然而，在300-400 mg/L時，ΔNO2–N/ΔNH4+-N顯著偏離1.32，這與0-50 mg/L時的情況相反。隨著磷酸鹽濃度的增加，出水pH升高的幅度逐漸變平（圖3b），例如400 mg/L時，ΔpH值僅占不添加磷酸鹽時的33%。如圖3f所示，隨著反應時間的延長，底物轉(zhuǎn)化率逐漸降低，在160-400 mg/L階段，由于磷酸鹽沉積物的存在，底物與生物質(zhì)之間的接觸受到阻礙，導致底物轉(zhuǎn)化率較低。因此，在高濃度磷酸鹽的存在下，SBR 中MAB的活性會嚴重惡化。

圖3 加入磷酸鹽MAB脫氮性能：(a) NH4+-N 濃度；(b) 酸堿度；(c) NO2–N濃度；(d)化學計量比；(e) NO3–N濃度；(f)底物轉(zhuǎn)化率

3 微生物群落變化

通過16S rRNA研究了不同磷酸鹽濃度下SBR中微生物群落的變化。三個時間的微生物樣品的OTU數(shù)量分別為311、300和297，圖4a揭示了SBR中的主要微生物：Planctomycetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi。其中，含有厭氧氨氧化菌屬的Planctomycetes仍處于優(yōu)勢地位，添加磷酸鹽后，S1中的Planctomycetes從初始的44.11%加至55.6%，然后在S2中下降至42.61%，屬水平上同樣。此外，Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi的豐富度均由S0的19.36%、11.95%、9.3%和6.53%下降到S1的16.09%、9.31%、4.38%和6.37%，然后上升到S2的19.53%、11.18%、11.59% 和 7.68%。這表明上述4個門與Planctomycetes存在競爭關系，且Planctomycetes是含鹽廢水中的優(yōu)勢菌種。
在屬水平上，Candidatus Scalindua是Planctomycetes中唯一的厭氧菌，其豐富度首先從41.87%增加到50.11%，然后下降到35.43%（圖4b）。這表明適當?shù)牧姿猁}劑量（PO43–P≤120 mg/L）可以促進MAB的生長，而高濃度的磷酸鹽則相反。MAB的減少導致總氮去除效率降低，僅次于Candidatus Scalindua的Actinomarinales的豐度從S0的11.4%變?yōu)镾1的8.71%并最終維持在10.46%。S0和S2的Wenzhouxiangella的豐富度沒有明顯變化。Marinicella是一種硫氧化細菌，可以將NO3?-N轉(zhuǎn)化為N2，其在S2中的相對豐度較S0下降了0.6%。在S2 期間，檢測到新屬Algibacter和Colwellia，豐度分別為5.76%和3.72%，其中Algibacter是從海水中分離出的革蘭氏陰性菌，需要 Mg2+才能生長。在整個過程中沒有觀察到聚磷酸鹽積累生物的存在，表明還原的磷僅用于沉淀和細菌生長。

圖4 門水平（a）和屬水平（b）微生物分布柱狀圖

同時使用了基于KEGG和COG的PICRUSt 分析功能基因。如圖5a所示，碳水化合物代謝的豐度（9.22-9.28%）相對較高，這表明磷酸鹽對微生物消耗碳源獲取能量沒有明顯影響。氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、外源生物降解代謝和膜轉(zhuǎn)運的豐度在S1時下降，然后在S2時上升。相反，能量代謝、輔因子和維生素代謝、信號轉(zhuǎn)導和細胞運動的豐度在S1中較高，在S2中較低。能量代謝豐度的下調(diào)表明高濃度磷酸鹽抑制了細胞內(nèi)物質(zhì)的產(chǎn)生和細菌的生長。這與Candidatus Scalindua豐度的下降是一致的。此外，復制重組和修復（6.71-7.11%）、細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸（3.95-4.38%）和細胞運動（3.34-3.79%）的相對豐度在 S1 中上調(diào)，在 S2 中下調(diào)，這表明高劑量的磷酸鹽會破壞微生物細胞，不利于細胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

圖5.基于(a) KEGG和(b) COG 數(shù)據(jù)庫的PICRUSt分析

4 EPS的變化

EPS是一種由微生物分泌的高分子聚合物，可以保護細菌免受外界有毒物質(zhì)的侵害。一般可分為可溶性EPS（SEPS）、松散結(jié)合型EPS（LB-EPS）和緊密結(jié)合型EPS（TB-EPS），它們的主要成分是蛋白質(zhì)（PN）、多糖（PS）和腐殖質(zhì)。在160 mg/L PO43–P 時，EPS的產(chǎn)量最初從2.74增加到3.66 mg/g 濕重。當磷酸鹽濃度超過200 mg/L 時，EPS 的產(chǎn)量急劇增加至11.25，然后降至7.57 mg/g 濕重（圖6）。總體而言，與不添加磷酸鹽相比，高磷酸鹽濃度下EPS的產(chǎn)量增加，這可能與沉淀的形成有關。惡劣的生活環(huán)境迫使微生物產(chǎn)生更多的EPS來保護自己免受損害，此外，PN/PS比值在160 mg/LPO43–P時達到最大值16.83，然后隨著磷酸鹽濃度的增加而降低，這意味著微生物細胞的疏水性降低了。EPS產(chǎn)量的下降可歸因于 MAB在有害情況下對細胞內(nèi)物質(zhì)的消耗。即由于MAB生物膜被磷酸鈣鎂沉淀覆蓋，內(nèi)部底物稀少，為了維持生理活動，微生物可以降解EPS以獲得能量。而EPS產(chǎn)量的下降不利于MAB抵抗磷的干擾，MAB的活性也有所下降。

圖6.不同磷酸鹽劑量下EPS含量的變化 PN：蛋白質(zhì) PS：多糖

5 磷酸鈣鎂的形成

如上文所述，流出物中的一部分還原磷以Ca7Mg2P6O24的形式沉積，隨著進水磷酸鹽用量的增加，生物膜上積聚的白色沉淀物逐漸增多。這可以看作是磷回收的一種手段。至于其他的磷酸鹽礦物，如羥基磷灰石（HAP，Ca5(PO4)3(OH)）和鳥糞石（MAP，MgNH4PO4·6H2O），在SBR的厭氧氨氧化生物膜上未檢測到，這可能與pH值和SBR中Ca含量有關。

在本研究中，當磷酸鹽濃度超過160 mg/L時，氮和磷酸鹽的物質(zhì)平衡被打破，隨著KH2PO4用量的進一步增加，進水pH值顯著下降。為了使進水pH值保持在7.5，加入氫氧化鈉進行酸堿中和。隨著氫氧化鈉的注入，在液相中觀察到白色絮狀沉淀。此外，隨著磷酸鹽用量的增加，所需的氫氧化鈉濃度也增加，產(chǎn)生更多的白色絮狀沉淀物，這些白色沉積物會粘附在生物膜上并延遲底物滲透到內(nèi)部生物質(zhì)中，正是由于這些非織造膜載體的存在，MAB可以富集成致密致密的生物膜，而不是漂浮和松散的顆粒。因此，MAB的新細胞不能以被沉淀覆蓋的顆粒為核，形成更大的顆粒。

鈣在堿性環(huán)境中與磷酸鹽結(jié)合形成磷酸鈣沉淀，然后與鎂結(jié)合形成Ca7Mg2P6O24。此外，生物代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性有機物可能會誘導磷酸鹽生物礦化，但其具體形成機制有待進一步研究。

總結(jié)

本研究首次探索了含氮含鹽廢水中不同磷酸鹽劑量下MAB的脫氮工藝。MAB的活性在含低濃度磷酸鹽時（0-30 mg/L）增強，高濃度時（160~400 mg/L），NH4+和NO2-的去除率下降，MAB相對豐度下降了15.4%。此外，沉積物的存在迫使微生物產(chǎn)生更多的EPS以保護自己免受損害。通過低濃度磷酸鹽促進MAB的厭氧氨氧化過程或?qū)}廢水脫氮處理有重大意義，SBR中磷酸鈣鎂沉淀的形成，或許為磷元素的回收提供了思路。

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參考文獻：

1.Si P, Li J, Xie W, et al. Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal[J]. Bioresource Technology, 2021, 325: 124707.