?百邁客單細胞轉錄組產品介紹

百邁客單細胞轉錄組測序產品基于10x Genomics Chromium系統利用8通道的微流體 “雙十字”交叉系統和油滴包裹技術，在單細胞水平進行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個細胞的表達譜，避免單個細胞的異質性生物學信息被大量細胞的均質化覆蓋。通過單細胞轉錄組，可鑒定細胞群、細胞亞群、篩選細胞群特有marker基因，并完成對細胞分化軌跡的追蹤，從而解析細胞異質性和發育軌跡。

導讀

背景：骨髓內B細胞的分化具有嚴格的調控網絡協調，這個基因調控網絡中的遺傳物質的變異是急性淋巴細胞白血病（ALL）出現的基礎，例如ETV6-RUNX1融合基因的出現會導致細胞分化停滯。本研究旨在分析沿B細胞譜系分化軌跡的轉錄因子活性，作為表征白血病骨髓中異常細胞狀態的參考，并確定維持癌癥特異性細胞狀態的轉錄因子，以進行更√確的治療。

方法：使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析正常的B細胞譜系分化和體內細胞狀態。

結果：從骨髓scRNA-seq中發現的淋巴樣細胞轉錄因子活性與前期ATAC和ChIP-seq數據高度一致。使用這種調節B細胞譜系分化的調節因子作為綜合參考，本研究對ETV6-RUNX1融合基因陽性的ALL病例的分析揭示了白血病細胞中多種ETS轉錄因子的活性升高，包括白血病全基因組關聯研究中ELK3。基因表達變化與白血病免疫微環境中的自然殺傷細胞失活和耗竭有關。此外，結果表明診斷時細胞周期在G1期的細胞越豐富，誘導化療期間缺乏分化相關的調節網絡變化，這兩個特點代表了化療耐藥的特征。為了靶向白血病調節程序，克服治療耐藥性，本研究表明抑制ETS轉錄因子會降低細胞活力。

結論：本研究提供了表征正常和白血病骨髓中B細胞譜系分化中轉錄因子活性的詳細圖譜，并為針對白血病免疫微環境和調節網絡的新治療策略提供了基礎。

實驗方法

材料：急性淋巴細胞白血病（ALL）初診和化療15天的骨髓樣本（BM）

方法：單細胞轉錄組測序、ATAC-seq、CHIP-seq、轉錄組測序

研究結果

1、在單細胞轉錄組中捕獲骨髓B細胞譜系分化軌跡

從具有11個cluster的HSC中分離出B細胞用于進一步分析（圖 1a），DNA轉移酶（DNTT，也稱為 TdT）和MME（也稱為CD10）基因區分早期淋巴祖細胞（LP，cluster 3），它們進展為表達CD19和G1期pro-B細胞狀態（圖 1b）。此外，3個pre-B細胞cluster（缺乏DNTT表達）在圖譜上分離。pre-B II和未成熟B細胞簇由MS4A1（CD20）定義。擬時序分析如圖1c所示。基于此分析的細胞狀態之間的進展與指定的分化階段一致。這些細胞狀態注釋也與使用流式分選B細胞群評分高度一致（圖 1d）。然而，這些由大量轉錄組定義的基因組僅在循環細胞狀態中得分很高。因此，本研究還從單細胞分析中區分了每個cluster的marker基因，以研究BM中B細胞譜系細胞狀態的分配。為了驗證，本研究選了兩個獨立的BM數據集：分別是健康的成人捐贈者和三個兒童BM樣本。從這兩種分析中，可以重現觀察到的B細胞譜的連續性。為了描繪表征早期B細胞譜系分化中細胞狀態轉變的基因表達變化，本研究沿著偽時間軌跡（HSC→LP→pro-B→pre-B→未成熟 B 細胞狀態）依次比較了細胞cluster。使用scDD區分了2201個基因的mRNA變化、平均表達的差異和模式，并且HCA和兒童BM之間具有高度的一致性。基于RNA速度分析該基因組的RNA動力學，進一步解析了B細胞譜系的細胞狀態（圖 1e）。在該分析中，剪接和未剪接計數均用于評估基因表達變化的速度，從而通過基因調控動態擴展細胞狀態表征。這由首先上調的 DNTT（圖 1f）說明這些細胞周期狀態和細胞周期中mRNA水平的變化 （圖1g）。

圖1 骨髓scRNA-seq中分離的B淋巴樣細胞分化狀態

2、TF活性變化揭示了B細胞分化的調控動態

沿B細胞譜系軌跡的細胞狀態轉換受TF嚴格控制。為了表征TF、共調節因子（CR）、染色質修飾（CM）和剪接/轉錄復合物（ST）的活動，使用在訓練集和測試集中可重復識別的TF作為線性模型擬合分析細胞狀態的重要預測因子。B細胞譜系分化階段的TF活性評分如圖2a所示。主要調節B細胞譜系循環的TF的表達水平見圖2b。EBF1、FOXO1、LEF1和TCF4與ETS因子ERG和FLI1一起在pro-B細胞中顯示出*高的活性（紅色），而TCF3和PAX5在pro-B細胞和pre-B細胞中的活性都相似。SPIB和IRF4活性在pre-B細胞中升高；一些已知的具有抑制功能的TF，如BCL11A和已知的協同抑制復合成分HDAC2 和TBL1XR1，它們與糖皮質激素受體相互作用以促進終末分化。

作為獨立驗證，首先從pro-B細胞中檢索了大量ATAC-seq數據，顯著富集的TF motif證實了與pro-B G1期細胞相關的9個TF（EBF1、FOXO1、TCF3、RFX5、IRF1、TCF4、LEF1、ERG、FLI1）（圖 2c）。pro-B活性TF在兒童BM數據集中也具有高度相似的活性譜（圖 2d）。接下來，分析了包括TF與目標基因表達相關性，以及每個目標基因位點的TF motif。根據發現集中找到的TF，在訓練/測試集中預測它們的靶基因。為了測試預測的靶基因是否受TF調控，本研究檢索了PAX5、EBF1和BCL11A的ChIP-seq數據，這些數據在人類細胞系模型 Nalm-6中可用，使用GREA T獲得與基因關聯的peak。對于PAX5和EBF1，超過75%的預測目標具有ChIP-seq peak關聯（圖 2e）。ATAC-seq motif富集與基于ChIP-seq的TF靶基因位點驗證，結果高度一致，證明TF活性評分反映了調節作用。說明本研究對健康人BM單細胞轉錄組的分析為基因表達和TF活性變化提供了全面的參考，這些變化表征了單細胞分辨率下早期B細胞譜系分化的特征。

圖2 調節B細胞譜系分化的轉錄因子活性

3、E/R白血病細胞類似于pro-B細胞狀態，并在細胞周期活動中表現出異質性

為了表征ALL（E/R）中常見的TF融合的白血病細胞，本研究對6個兒童E/R+ pre-B-ALL病例進行了scRNA-seq，收集6個診斷期和2個誘導化療第15天的BM樣本（圖 3a）。基于DNTT表達及其與正常BM細胞類型的明確分離，確定了每個供體中的白血病細胞簇（圖 3b）。基于B細胞譜系簇特異性基因集，發現診斷時白血病母細胞類似于pro-B分化狀態（圖 3c）。該分析同樣將pro-B細胞鑒定為*接近的正常分化狀態，這與之前的研究一致。細胞周期狀態在不同情況下不同，ALL3中的循環細胞比例*低，ALL9中的*高比例（圖 3d）。對于具有中期誘導治療的2個病例（ALL10 和 ALL12），在第15天收集的樣本中細胞分離為不同的細胞狀態（圖 3a、d），表明治療進一步改變了白血病細胞狀態。

通過分別比較循環和G1期細胞與正常pro-B細胞的基因表達分布，進一步表征診斷時E/R白血病細胞與pro-B細胞的不同。該分析是基于HCA健康人BM和兒童BM pro-B細胞進行的。對于大多數基因，正常B細胞譜系分化時*顯著的變化是ZP指標，該指標捕獲感興趣基因計數為零的細胞部分，例如前50個上調和下調的基因在 pro-B到pre-B中的過渡。因此，本研究使用ZP對來自HCA的E/R+和pro-B細胞的G1期和循環細胞狀態比較中發現的272個上調和90個下調基因進行聚類（圖 3e）。與沿B細胞譜系分化軌跡的其他細胞狀態相比，大約1/3的上調基因在 E/R+ 細胞（cluter 4）中處于*高水平，而cluter 1、2、5 和 6 中的基因在白血病和正常干/祖細胞中表達（圖 3e）。一小部分（19 個基因，cluter 8）在正常的未成熟 B 細胞中高度表達，并且發現16個基因僅與小兒BM相比具有顯著性。考慮到一些基因表達模式類似于pre-B 細胞狀態，但白血病細胞似乎停滯在pro-B狀態，因此進一步確定了在pro-B到pre-B過渡中通常受調節的基因，發現其他基因與分化停滯有關。總的來說，在過渡到pre-B狀態時正常上調的 97 個基因保持在與正常 pro-B 細胞相似的低水平，而在分化過程中下調的145個基因在白血病細胞中仍然表達。

通路富集分析顯示，一些上調基因與細胞因子、趨化因子和生長因子通路相關，特別是那些參與NK細胞介導的細胞毒性負調節的基因。之前在ALL中的一項研究表明，免疫逃避中 TGF-β增加。因此，與E/R+ G1期細胞向pro-B G1期細胞的表達分布相比，TGFB1和有助于降低NK細胞募集和激活的3個基因LY6E、TERF2和HLA-E上調表達（圖 3f）。

圖3 E/R+細胞與正常pro-B細胞的比較

4、E/R+ BM免疫微環境中NK細胞的豐度和活性較低

對BM免疫細胞進一步分析，發現與HCA BM供體相比，E/R+ BM中的GNLY或NKG7陽性NK細胞數量顯著減少（圖 4a）。此外，根據流式細胞分離數據，淋巴細胞中的NK細胞計數在E/R+與非E/R pre-B-ALL中*低（p=0.025）。

為了進一步表征免疫細胞群，將HCA和E/R+ ALL供體的T細胞和NK細胞匯集在一起進行聯合分析。基于聚類和marker基因分析，可以區分幾種不同的NK細胞類型（圖 4b、c）。篩選表達GNLY或NKG7的cluster（cluster 0、2、3、7、10、11、16），發現與來自HCA供體的NK細胞相比，來自ALL BM的NK細胞被隨機分配給這些cluster（圖 4d）。具體來說，所有NK細胞主要代表cluster 10和16，它們與表達未成熟CD56bright 和過渡NK細胞的顆粒酶 K（GZMK）相匹配（圖 4e 中的基因組評分代表來自scRNA-seq研究的NK亞型）。相比之下，大多數正常 BM NK細胞代表表達顆粒酶 B（GZMB）和穿孔素（PRF1）的成熟或終末NK細胞（cluster 0）。因此，E/R+白血病細胞可能會主動逃避NK細胞的細胞毒性，然而，NK類型的頻率因供體而異（圖 4f）。高表達IFNG的cluster 7幾乎完全對應于HCA供體 3，而與其他ALL病例相比，細胞周期高度活躍的ALL8和ALL9更類似于正常BM中的成熟或活性NK細胞譜。總之，白血病細胞狀態與正常pro-B分化狀態的不同之處在于干/祖細胞特異性基因和幾種免疫調節基因的高表達。免疫調節基因的變化反映為E/R+ BM內更多不成熟的NK細胞類型。

圖4 E/R+骨髓中的NK細胞數量和活性較低

5、白血病調節程序揭示了 TF 活動中的細胞狀態和白血病相關風險基因

為了進一步破譯有助于將E/R+白血病細胞與正常淋巴細胞狀態區分開的異常TF活性，本研究重復了TF活性分析（圖 5a）。2/3通過線性模型擬合的TF（R2 > 0.5）在pro-B細胞中有活性，在E/R+細胞中活性升高，包括ETS因子（ELK3、ERG、FLI1）、FOXO1、MAX、MAZ 、SP4、TCF4和THAP11。分析還揭示了RFX5和NFYC在 E/R+原始細胞中的高活性，通常僅在未成熟的B細胞狀態下達到峰值。此外，E/R+細胞中活性下降的TF包括 RUNX1、SPIB、TCF3 和 IRF4（圖 5a）。

基于bulk RNA分析可以驗證它們在B-ALL中的表達，在E/R+亞型（紅色箭頭）中檢測到的比例*高，如在t-SNE圖上比較血液系統惡性腫瘤所示（圖 5b），其中惡性淋巴瘤在圖上突出顯示。兩種常見的B-ALL亞型（E/R+和高超二倍體病例）顯示出類似的高ELK3，而升高的SP4則更具 E/R 特異性，進一步分析了E/R+細胞中的這些TF基因座（圖 5c）。本研究使用GRO-seq對E/R+ BM中的新生轉錄進行了分析，揭示了Pol2參與編碼和非編碼區的主動起始和延伸。GRO-seq 證實了這些基因位點在 E/R+細胞中的轉錄活性（圖 5c）。此外，還揭示了ELK3上游未注釋（Refseq、UCSC 或 Gencode）的轉錄起始位點（TSS）（圖 5c）。兩個lncRNA庫在該基因組區域內具有匹配的轉錄本，但注釋之間的一致性很差。因此，在E/R+ BM（n = 8，scRNA-seq 和 GRO-seq 分析中的匹配樣本）中使用配對的bulk RNA-seq 進一步檢測了該基因座內的剪接模式。帶注釋的ELK3轉錄本具有來自剪接點跨越reads的支持，而上游轉錄本與lncRNA結構*匹配（圖 5c）。

圖5 E/R+白血病細胞中的TF活性

6、化療期間持續存在的白血病TF為克服耐藥性提供了新的靶點

基于在ALL10和ALL12中誘導治療中期獲得的scRNA-seq譜分析了標準白血病誘導治療（潑尼松龍、長春新堿、多柔比星）對 TF表達的影響（圖 5d）。基于差異分布分析，與兩個樣本中的診斷時狀態相比，來自第15天骨髓的殘余白血病母細胞具有較低的RUNX1、TCF3、SOX4和ERG表達，而SMAD1和ELK3水平略有增加。在第29天誘導結束時，ALL10的原始細胞減少（0.08%）。在第15天，pre/未成熟B TFs POU2F2、KLF2/6、AFF3和SPIB在ALL10的剩余白血病細胞（10%原始細胞）中的表達升高。這些變化可能與糖皮質激素的分化誘導作用有關。但總體而言，TF活性或基因表達的變化不大，表明盡管成熟CD20（由MS4A1編碼）增加，但僅可能發生向pre-B細胞狀態的部分分化。相比之下，ALL3和ALL12對治療的反應緩慢（第 15 天的原始細胞率為74%和59%；誘導結束時分別為0.16%和0.2%）。ALL3與其他E/R+病例相比，診斷時細胞周期狀態分布強烈偏向G0/G1狀態（圖 3d），這可能是對靶向分裂細胞的藥物（阿霉素/長春新堿）耐藥的基礎。ALL12第15天TF譜表明白血病基因調控程序的持續性，表現為缺乏pre-/未成熟B TF上調（圖 5d）。

總結

該研究首次全面表征了E/R+ ALL病例中的細胞狀態和TF 活性，并將其與單細胞分辨率下的正常人類 B細胞譜系分化進行了比較，進一步證明了使用單細胞基因組學監測早期治療反應的可行性及其發現新治療靶點的潛力。通過對單細胞和大量基因組數據的聯合分析，表征了導致白血病細胞異常細胞表型的TF譜。這些結果可以為開發針對白血病免疫細胞串擾和治療抗性白血病細胞狀態的新療法提供合理的依據。

原文下載鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33218352

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