?在AD的過往研究中，大家發現淀粉樣斑塊周圍存在復雜的炎性樣改變，但我們對這種反應的分子變化和細胞間的相互作用知之甚少。本文利用空間轉錄組技術研究一個AD小鼠模型，可以分辨淀粉樣斑塊周圍直徑為100μm的組織結構域轉錄變化。實驗數據證實了一個早期髓鞘和OLIGs富集的基因共表達網絡變化，以及一個涉及補體系統、氧化應激、溶酶體、炎癥的PIGs多基因共表達網絡。作者進一步通過人鼠大腦切片的原位測序在細胞水平證實了觀察到的大部分改變。可以說全基因組空間轉錄組分析為AD和其他腦部疾病提供了一種方法來解密致病特征附近的細胞網絡異常。

研究背景

NGS技術飛速發展，在生理和病理方面定義細胞狀態得到巨大進步。例如，在AD領域，我們現在知道小膠質細胞對β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊表現出典型的活化反應。神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞比小膠質細胞更難分離，但單細胞核是一個合適的選擇。這些細胞的胞質mRNA不能很好的展示，而且解離手段誘導了人為的表達改變。基本的問題還是，丟失了大部分的空間信息，包括細胞和淀粉樣蛋白斑的關系。而空間轉錄組可以解決這一問題，它的空間標簽陣列可以記錄測序分子的空間位置，無偏地分析組織上的轉錄本信息。

目前AD研究的一個中心問題是淀粉樣蛋白斑和神經退行性進程的關系。這個斑塊可能是AD的觸發器或者驅動器。遺傳分析表明，散發性AD的風險與小膠質細胞中表達的對淀粉樣蛋白沉積有響應的基因有關，但是星形膠質細胞、神經元、少突膠質細胞也對蛋白斑有分子響應。“AD的細胞相變”研究致力于綜合地了解這些細胞間漸變的復雜相互作用，這也確定了Aβ沉積引發的致病結果。然而，我們對淀粉樣斑塊附近細胞中發生的分子變化依然知之甚少。

 

研究方法

一、?實驗材料

人組織：AD晚期和正常對照大腦，女性（75歲左右）

鼠：?App^NL-G-F?KI、C57BL/6J，雄性

二、?實驗技術

空間轉錄組測序、原位測序

三、?實驗流程

實驗結果

作者使用3、6、12、18月齡的App^NL-G-F和C57BL/6小鼠大腦進行冷凍切片，每只切三片，外側做免疫組化，中間做ST（圖1A）。每個冠狀切面包含500多個TDs的轉錄譜，20個切片合計10327個轉錄譜。并對每個TD進行了空間、病理和細胞信息的注釋。實驗中每個TD檢測到31283± 7,441個唯一分子標簽和6,578 ± 987唯一基因。作者將每個冠狀切片與艾倫小鼠大腦圖譜鑒定的14個解剖大腦區域進行匹配(圖1B),并且每一個TD都被分配其中。TDs的數量介于112（內嗅皮層ENTI）和2114（丘腦TH）之間（圖1B）。最后將三張切片整合，用Aβ負荷（6E10染色）、反應星形膠質細胞（GFAP）、神經元（NeuN）以及細胞核（DAPI）對其進行注釋。

 

圖1 | 成年小鼠大腦的空間轉錄圖譜

 

一、?成年小鼠大腦的空間轉錄組結果

作者對10327個轉錄譜進行t-SNE分析聚類（圖1C），并且對年齡和基因型也進行了很好的區分（圖1D）。分區結果表明了ST技術可以清晰地分辨出大腦解剖區域。野生型（WT）的斑點在12月齡和18月齡有所重疊（圖1D紫色和紅色），而App^NL-G-F的轉錄譜在這兩個時間點一直改變（黃色和綠色），這也與這段時期的病理進展一致。

二、?將基因表達變化與Aβ沉積進行關聯

App^NL-G-F小鼠的淀粉樣沉積從3月齡左右開始（圖2A）。在18月齡的切面上，78.5–4,950 μm²區域內有1,565 ± 167個斑塊。單個TD的直徑是100 μm,切片厚度也是100 μm。因此，有理由認為中間切片的細胞接觸到了鄰近切片檢測到的淀粉樣斑塊。作者使用一個TD上的Aβ像素熒光強度的標準偏差作為Aβ指標。這種方式可以區分輕微的和強烈的Aβ堆積（圖2B）。作者平均了每個腦區TD的Aβ指標（圖2C），這與Aβ免疫染色一致，說明Aβ從背部往腹部皮層、丘腦、海馬區進展。

為了解基因表達的變化，作者進行了兩個差異表達分析。首先比較App^NL-G-F?和 C57BL/6（基因模型），其次是Aβ沉積對基因表達的影響（Aβ模型）。作者使用6個轉錄本進行經典的RNA原位雜交實驗來驗證Aβ模型（圖2D&E），根據模型，18月齡的App^NL-G-F，Cst7，Cd68，C1qa，Slc1a3，Clu和Mbp表達異常。在圖2D中可以看到,ST的數據和RNA原位雜交數據高度相關，這也證實了本方法的有效性。

具有相似表達模式的基因很可能擁有相似的功能，因此可以通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）進行模塊聚類。作者研究了10327個轉錄譜中變化程度*大的50%的基因，識別出12個模塊，并使用GOrilla提取了可能的生物學功能、Aβ暴露的表達變化、3月齡和18月齡的基因型、細胞特征、受影響的腦區。

三、?PIG模塊的鑒定

WGCNA分析中紫色的模塊被稱為PIGs，在18個月齡時，它在Aβ和基因型軸上*活躍（圖S3B）。這個模塊包含57個基因，開始時微微上調（圖3A），6-12月時在整個大腦中急劇增加至一種穩定的狀態（圖3B）。18月齡App^NL-G-F小鼠的所有TDs在Aβ沉積和PIG中間存在一個中等但顯著的相關性（圖3C）,說明PIG表達隨著整個大腦中Aβ的沉積逐漸增加。

根據GO分析，作者得出該模塊參與了經典補體級聯，以及補體級聯觸發的效應機制，如內吞作用，溶酶體降解、抗原處理和遞呈、免疫應答和氧化還原過程。

作者進一步研究了PIG模塊的細胞學特征，鑒定出其與激活的小膠質細胞（疾病相關DAM或者激活響應的ARM）和炎性星形膠質細胞（A1）有關聯（圖S3D）。重點突出了5個與A1標記重疊的PIGs和15個DAM/ARM 基因（圖3D）。另外36個PIGs以前并沒有被定義為疾病相關的神經膠質基因。激活的小膠質細胞和星形膠質細胞參與了前十的聯系*緊密的樞紐基因（圖3D,紅色）。作者評估這些PIGs是否可以在人數據庫中被鑒定出來。在41個細胞亞群中，與PIGs*相關的是AD相關的小神經膠質細胞（Mic1，圖S3E）。作者通過參與Aβ暴露和基因型的人Mic1??Marker基因的同源序列來放大基因表達變化（圖3E&F,橙&綠）。對小鼠的分析表明，人腦中的Mic1反應是對淀粉樣蛋白斑塊的大量的多細胞協調反應的一部分，而且這種反應會隨著時間的推移而演變。

圖S3 | GO分析和WGCNA共表達網絡分析

圖3?| Aβ斑塊誘導基因（PIGs）的鑒定

 

四、?使用原位測序在細胞分辨率下研究PIG模塊

ST展示了淀粉樣蛋白斑周圍的多細胞反應，作者尋求一種正交獨立方法從單細胞分辨率下進行驗證。原位測序（ISS）可以在一個反應中使用許多靶向特異的原位標簽。作者使用了特制的探針來繪制PIGs表達以及細胞類型標簽（Itgam、 Cx3cr1、Csf1r對應小膠質細胞;Slc1a3、Gfap 、Clu對應星形膠質細胞; Syp對應神經元; Plp1對應少突膠質細胞；圖4A-C）。ISS實驗中，對App^NL-G-F和兩只18月齡WT小鼠各構建兩個文庫。用每個基因的熒光點數目來量化基因表達，并將熒光點聚類到淀粉樣蛋白斑周位的5個同心圓上（圖4D）。51/54個PIGs在圈1上明顯富集，而C1qb在圈1上明顯減少（圖4E）。ISS的結果與ST的結果線相關性非常好（圖4E）。

作者開發了一種算法來檢測PIG網絡的細胞特征，通過計算5μm半徑內的細胞類型Marker斑點的富集來匹配每個斑點到細胞型。通過預測每個Marker基因的細胞類型來驗證這個算法（圖4G）。很明顯，PIG響應Aβ，這主要是因為小膠質細胞，小部分由于星形膠質細胞（圖4H）。而一些PIGs在多種細胞類型中明顯富集。例如，Cyba在小膠質細胞和少突膠質細胞中表達。

最后，作者使用RNA原位雜交，驗證18月齡App^NL-G-F的補體部分（C1qa、C4、 Clu)表達。實驗證實了C1qa在Itgam陽性細胞（小膠質細胞）中表達，Clu在?Slc1a3陽性細胞（星形膠質細胞）表達，C4在Mbp陽性細胞（少突膠質細胞）表達，這些細胞緊挨淀粉樣蛋白斑。這三個補體部分的細胞特征經過RNA原位雜交檢測，與ISS分析結果一致。

 

圖4 | ISS鑒定的PIGs細胞標簽

 

五、?PIG模塊中小膠質細胞基因和星形膠質細胞基因的共表達

為了探究PIGs在不同細胞中表達的相關性在多大程度上是由累積的Aβ病理驅動的，作者僅在PIGs上使用WGCNA分析，根據Aβ標簽分離所有ST的TDs為WT和四個AD分位數（圖5）。WGCNA生成了一個連接矩陣，表明每個基因的改變是如何與其他所有基因的關聯的。圖5展示了隨著Aβ暴露，共表達網絡逐漸形成。

在WT中，所有PIGs的關聯相對較低，PIG被分為三個簇（圖5，綠、藍、橙）。ISS實驗（圖4H）證明了在綠色簇中，星形膠質細胞基因（7/12）富集，而藍色（14/23）和橙色（14/28）簇聚集了小膠質基因中表達的PIGs。在WT中，橙色的PIGs幾乎不關聯，而App^NL-G-F小鼠中，在接觸增長的Aβ后，這些PIGs的基因被招募。隨著Aβ指標增長，PIGs內部和相互之間的關聯增強。在Q4-Q1中，隨蛋白斑積累程度增加，互作關系明顯增加。

 

圖5 | 隨Aβ沉積，PIGs逐漸共表達

 

六、?少突膠質細胞模塊的不同區域反應

第二個變化比較大的模塊（紅色），在WGCNA(圖S3B)，由165個基因構成，他們主要在少突膠質細胞中表達，因此命名為“OLIG模塊”。這個模塊最富集的功能種類是GO:0007272包膜神經元、GO:0043209髓鞘、GO:0008366軸突包膜以及GO:0042552髓鞘形成。模塊最富集的10個基因是髓鞘相關的轉錄本：Plp1、Mbp、Mobp、Cldn11、Mal、Apod、Cnp、Trf、Fth1、Plekhb1。比較OLIG與過往發表的小鼠單細胞數據，少突膠質細胞關聯很強（圖S3C）,活化小膠質細胞（DAM/ARM）輕度關聯（圖S3E）。OLIG與人AD相關的少突膠質細胞Oli0關聯密切（圖S3E）。作者突出標記了20個人類Oli0 markers同源序列（圖6A&B，橙色、綠色）。幾個Oli0同源序列與OLIG模塊同步上調和下調。

類似于髓鞘類（圖S3A）,與3月齡和18月齡的WT小鼠相比，App^NL-G-F小鼠在OLIG模塊的基因型軸線全腦范圍上全部上調（圖6A&6B）。這種基因型效應可能反映了小鼠大腦對人源和突變的App基因的整體反應。但是，從基因型中把Aβ暴露（Aβ軸）分理出后，作者發現了一個OLIG模塊的有趣變化：在3個月時，全部呈正相關，在18個月時為負相關（圖6A&6B）。在不同的大腦區域，這種反應也有明顯的差異（圖6C）。比較圖2C中淀粉樣蛋白斑和OLIG表達，可以明顯發現OLIG表達的主要驅動因素不是Aβ指標而是大腦區域本身（圖6C）。在3月齡時，作者發現在纖維束（FB）、丘腦（TH）和下丘腦（HY）中顯著的OLIG-Aβ正相關，而在內嗅皮層（ENTI）和幾個海馬體皮層中存在顯著負相關。在18月齡時，作者在聽覺區域（AUDS）發現了OLIG-Aβ存在明顯負相關，而在ENTI和海馬體中存在顯著正相關。

作者進而更詳細地從Aβ指標和OLIG表達的關系方面分析這些區域的不同。在圖2中，Aβ沉積隨疾病的進展而不同。甚至在3個月時，有些TDs暴露于Aβ（圖5，Q1中179個TDs）。隨著Q4-Q2中TDs的Aβ緩慢增長，OLIG表達增加（圖6D）。但是，三月齡有著*高Aβ暴露（Q1，比Q4中Aβ高21倍）的TDs中OLIG的表達存在一種降低的趨勢。另外，低Aβ暴露的TDs中OLIG模塊的基因對的連接強度之和*強。為了進一步證明發現，作者對三月齡App^NL-G-F小鼠的整個冠狀切片，設計四個OLIGs（Plp1、Mbp、Olig2和Cnp）探針做RNA原位雜交（圖6E&F）。結果顯示，在三月齡小鼠稠密的淀粉樣蛋白斑周圍，這4個OLIGs明顯減少。可以推測，在輕度Aβ暴露下，OLIG模塊高表達和相互連接，但在高密度Aβ積累的微環境中表達減少。因此，部分OLIG模塊的區域差異與不同的Aβ暴露有關。

圖6 | 隨Aβ積累，OLIG模塊的時空響應

 

七、?人腦中PIG和OLIG模塊的可視化

作者使用3名AD患者和3名正常對照組死后的人腦樣本進行實驗。AD大腦處于淀粉蛋白斑C階段和神經元糾纏V-VI階段的疾病進展期。研究描繪了與AD相關的額上回組織譜，總共報告了222個基因表達譜，包括45個人PIGs同源序列，OLIG模塊中42個斑塊反應基因的同源序列，以及一系列細胞類型Marker。這些細胞Marker很好地在細胞分辨率下描繪了大腦區域（圖7A）。PIG模塊（圖7B,紫色）和OLIG模塊（圖7C,紅色）基因如預期的在大腦灰質和白質中富集。

作者使用分析小鼠ISS數據的方法來研究對照組中人PIGs和AD大腦同源序列的分布。大部分PIGs在AD和對照組中相同的細胞類型中表達。在對照組中，PIG模塊中3個子模通過星形膠質細胞（綠色簇）和小膠質細胞(藍色和橙色簇)表達（圖7D）。然而，作者依然在神經元中發現了9個富集的PIGs(LGMN、HEXB、HEXA、CTSB、CTSA、GNS、GPX4、CTSD和ITM2B)，兩個在少突膠質細胞中富集（LGALS3BP和CD9）。PLEK、CYBA和LAPTM5在小鼠的少突膠質細胞中顯著富集，而在人類的小膠質細胞中顯著富集。作者最終確定18/45的個PIGs在淀粉斑細胞位上明顯富集，包括9個小膠質細胞PIGs，5個星形膠質細胞PIGs以及5個多細胞類型表達的PIGs。有趣的是，作者發現APOE和ARPC1B在小膠質細胞中顯著表達，NPC2、 S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR在AD患者星形膠質細胞中顯著表達，而在對照組中沒有，提示在AD患者中疾病相關的膠質細胞激活。

作者使用類似的方法，從OLIG模塊中差異表達*高的基因選出42個人類同源序列的細胞進行細胞特征分析（圖7E）。淀粉樣斑塊細胞生態位中有22個基因顯著缺失，5個基因在淀粉樣斑塊細胞生態位中顯著增高表達。有趣的是,通常由少突膠質細胞表達的APOD在大腦中表達，并在AD中上調，在AD患者的小膠質細胞中也顯著富集，但在對照組中沒有。

對比人和小鼠的數據，需要顧及物種差異，在鼠中，只有淀粉樣斑塊誘導的病理進行了研究，然而，AD的后期階段，Tau蛋白、壞死性凋亡等等對病理的額外貢獻導致病理情況變得復雜，并沒有出現在小鼠模型中。小鼠模型反映了疾病的早期階段，而人從淀粉斑出現到最終發展為癡呆需要長達20年的時間。人類疾病發生的過程會更加復雜，不過小鼠中鑒定出的PIG和OLIG模塊會在AD晚期有重要作用。

圖7 | 通過ISS使人腦中PIG和OLIG模塊可視化

 

文章總結

本文使用空間轉錄組在數百個微小組織區域（TDs）進行原位測序，發現了淀粉樣蛋白斑誘導的全基因組轉錄組改變。同時使用正交的原位測序方法在單細胞水平分析了數百個重要基因。進而繪制了響應Aβ沉積的兩個基因共表達網絡—-PIGs和OLIG。分析數據發現淀粉樣蛋白斑并不是簡單的“發病結果”，還會誘導一系列的基因變化 ，影響疾病進展。