近日，中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究所在Food Research International （IF=5.0）雜志發(fā)表了Caffeic acid prevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat diet through gut microbiota modulation in mice一文，探討了咖啡酸在小鼠腸道中對微生物菌群的影響，從而為非酒精性脂肪性肝病的預防提出新的見解理論基礎。其中微生物多樣性檢測由百邁客協(xié)助完成。

研究背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全世界關注的主要健康問題;它是一種主要的隱性疾病，會增加罹患多種慢性疾病的風險，如2型糖尿病和心血管疾病。NAFLD患者有發(fā)展為脂肪肝、肝硬化甚至肝細胞癌的風險。然而，NAFLD的誘導和進展的病理機制復雜，目前還沒有明確的靶向藥物。改變生活方式和改變飲食是目前緩解NAFLD的主要策略。因此，確定NAFLD的新靶點和治療方法仍然是一個挑戰(zhàn)。

NAFLD是由肝細胞內脂肪過度堆積引起的，新生脂肪生成是脂肪儲存的重要途徑。肝臟脂肪生成主要由固醇調控元件結合蛋白1 (Srebp1)調控，Srebp1增強脂肪生成基因的后續(xù)激活，包括脂肪酸合成酶(Fas)、乙酰輔酶a羧化酶(Acc)和硬脂酰輔酶a去飽和酶1 (Scd1)，導致肝臟脂質積累。此外，NAFLD的發(fā)病和進展是眾所周知的與炎癥有關。腸道衍生毒素，如脂多糖(LPS)，被認為在肝臟炎癥中具有致病作用，并與NAFLD密切相關。一方面，有報道稱LPS可促進Srebpl激活和肝臟脂質積聚。相反，LPS通過激活肝臟toll樣受體4 (TLR4)/核因子-κB (NF-kB)信號通路觸發(fā)炎癥反應。

近年來，腸道菌群與NAFLD的關系引起了廣泛關注。腸道微生物群產生促炎LPS并進一步影響肝臟脂質代謝，已成為NAFLD發(fā)展的重要參與者。研究表明，高脂肪飲食(HFD)喂養(yǎng)的無菌小鼠肝臟中的脂質水平低于傳統(tǒng)飼養(yǎng)的小鼠。此外，將從高脂飲食誘導的肥胖供體中分離出的腸道微生物移植到無菌動物中，會導致受體小鼠體重顯著增加和代謝綜合征。因此，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對維持健康至關重要，確定腸道菌群的組成對于研究NAFLD與失調之間的致病關系和潛在致病聯(lián)系是必要的。

咖啡酸(CA)，也被稱為3,4 -二羥基肉桂酸，是最常見的酚酸之一，存在于大多數植物中，包括咖啡、水果和丹參。CA在人類飲食中廣泛使用。越來越多的證據證實CA具有多種生物功能，包括抗氧化和抗炎活性。與此同時,據報道,CA減少alcohol-fed老鼠的肝臟脂質含量,抑制油的段脂肪生成人類HepG2細胞,和改善小鼠的肝脂肪變性和內質網應激通過增加自噬。然而，CA作用于脂質積累的機制尚不清楚。枸杞葉提取物含有多種酚酸，包括CA，有研究表明，枸杞葉提取物可以通過調節(jié)代謝譜和腸道菌群組成來改善大鼠2型糖尿病。然而，目前尚無關于CA對NAFLD腸道菌群影響的研究報道。本研究旨在探討CA對NAFLD的降脂作用及其機制，尤其關注其對腸道菌群的影響。

英文名稱: Caffeic acid prevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat

diet through gut microbiota modulation in mice

中文名稱:?咖啡酸通過調節(jié)小鼠腸道菌群預防由高脂肪飲食引起的非酒精性脂肪肝

雜??志：Food Research International

影響因子：5.0

材料方法

1、實驗材料：

6周齡雄性C57BL/6J小鼠，正常鼠糧(ND, 1025)、ND添加0.08%或0.16% CA 、HFD(合成飼糧添加0.15%膽固醇，w/w, H10141)，HFD添加0.08%或0.16% 。

2、研究方法：

在ND適應1周后，將小鼠隨機分為2組:ND組(n = 30)和HFD組(n = 30)，治療8周。

ND組小鼠隨機分為3組(n = 10)，飼喂特定飼料，為期8周。這些組包括:1)喂食正常食物的ND小鼠;2)低ND+CA，喂食CA含量為0.08%的正常鼠糧;3)高ND+CA，喂食CA含量為0.16%的正常飼料。同時，高脂飲食組按以下飼料隨機分為3組(n = 10)，飼養(yǎng)期8周。這些組包括1)高脂飲食小鼠;2) HFD+CA-low組，高脂日糧中添加0.08% CA;3) HFD+CA高組，飼喂添加0.16% CA的高脂飼糧，每2周測量體重。

最后用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉小鼠。小鼠經心臟穿刺采血后處死，取肝臟稱重。回腸、盲腸和結腸內容物無菌收集，立即置于- 80°C保存至使用。

研究結果

1.補充CA可降低高脂喂養(yǎng)小鼠的脂質積累

? ? ? ?本研究旨在評估CA治療高脂喂養(yǎng)小鼠的潛在益處，重點關注在NAFLD發(fā)病機制中，除了調節(jié)內毒素相關炎癥信號機制和脂代謝改變外，恢復腸道菌群平衡可能與之有關。為了研究CA對脂質積累的影響，我們分別用低濃度和高濃度的CA喂養(yǎng)小鼠。肝脂肪變性是主要的組織病理學表現;在其他研究中觀察到，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的肝臟比三組ND小鼠的肝臟出現更多的脂肪變性，宏觀上黃色和堅硬的紋理證明了這一點(圖1A)。值得注意的是，添加0.08%或0.16% CA的HFD小鼠肝臟表面呈紅褐色，質地柔軟。肝切片HE染色(圖1B)和油紅O染色(圖1C)證實了這一點。與ND組相比，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪滴更多、更大，而CA處理的小鼠脂肪滴更少。與ND組相比，HFD干預8周后小鼠體重顯著增加，并持續(xù)增加至16周。然而，從第8周開始，飼糧中添加0.08%或0.16%的CA可以有效地緩解hfd誘導的體重增加，特別是在第14周(CA濃度均為)和第16周(僅添加0.08% CA)時(圖1D)。在肝臟重量(圖1E)、體重(圖1F)和肝臟/體重(圖1G)以及兩種濃度的CA處理中也可以觀察到類似的結果，這降低了hfd誘導的肝臟重量、體重和肝臟/體重的增加。與只喂食ND組相比，添加CA的ND組對這些指標沒有任何差異。

圖1

2.CA的補充影響hfd喂養(yǎng)小鼠的生化標記物

? ? ? ? ?血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現高脂血癥。CA處理在低和血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現高脂血癥。CA處理在低和低濃度的TC、HDL-C和LDL-C對hfd誘導的血清高脂血癥有緩解作用。但各組間血清TG水平無顯著差異(圖2A-D)。在HFD組中，ALT、AST、葡萄糖和hsCRP水平均升高，而在喂食HFD的小鼠中，添加兩種濃度的CA只恢復了血清中ALT和葡萄糖(圖2E-H)。添加CA的ND小鼠與只添加ND的小鼠表現出幾乎相同的結果。

? ? ?圖2

3.補充CA可調節(jié)高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪生成相關蛋白表達

Srebp1是大多數肝脂合成基因的主調控基因，包括Fas、Acc和Scd1。Fas為TG提供非酯化脂肪酸底物，導致脂肪酸合成和TG積累增強。Acc將乙酰輔酶a轉化為丙二酰輔酶a，參與脂肪酸合成。Scd1有助于脂肪酸去飽和。Srebp1及其靶基因Fas、Acc和Scd1在NAFLD中上調，抑制Srebp1活性可抑制Fas、Acc、Scd1和TG的積累。接下來，我們評估了CA對高脂喂養(yǎng)小鼠新生脂肪形成相關蛋白表達的影響。我們的結果表明，與對照組相比，HFD顯著上調了肝組織中Srebp1、Fas、Acc和Scd1的表達，而低濃度和高濃度CA的補充均不同程度地減弱了該表達。添加CA的ND小鼠與只給ND小鼠沒有明顯差異(圖3A-E)

?圖 3

4.補充CA可減輕高脂喂養(yǎng)小鼠的內毒素血癥和隨后的促炎反應? ? ? ? ?

有報道稱，NAFLD的特征是腸道菌群改變、炎癥和腸道屏障破壞。肝組織炎癥被認為是肝脂肪變性發(fā)展的驅動因素，腸道源性脂多糖被認為在肝臟炎癥中具有致病作用。最近的動物實驗研究關注了腸道菌群LPS在NAFLD發(fā)生中的作用。腸道源性LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，通過TLR4信號通路和下游炎癥級聯(lián)反應促進炎癥反應。有報道稱，在NAFLD模型中，與野生型小鼠相比，tlr4缺陷小鼠的肝損傷、炎癥和脂質積累減少。此外，阻斷腸道菌群與宿主細胞之間的脂多糖- tlr4相互作用可以阻止高脂喂養(yǎng)小鼠NAFLD的啟動和發(fā)展，這證實了脂多糖- tlr4通路在誘導NAFLD中具有非常重要的作用。與之前的研究結果一致，我們的研究表明，16周高脂飲食導致血清LPS和肝臟TLR4表達顯著增加，肝組織中磷酸化的NF-kB p65被激活，表明炎癥開始。同時，高脂喂養(yǎng)小鼠血清TNF-a、IL-6水平升高，肝臟mpo陽性細胞浸潤。所有劑量的CA補充均顯著扭轉了上述現象;在添加ca的ND組中沒有觀察到顯著差異(圖4A-G)。

圖4

5.補充CA可減少高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群失調

? ? ? ? 越來越多的證據表明，腸道微生物群是NAFLD發(fā)展和進展中的一種新的生物標志物，它通過涉及炎癥反應激活和代謝調節(jié)的機制促進其發(fā)展。腸道菌群失調導致NAFLD的可能機制可歸納為:干擾能量收獲和支出之間的平衡,促進肝臟炎癥(損害腸道完整性、促進內毒素和啟動與細胞因子釋放炎癥級聯(lián)),并改變生物化學代謝和腸道m(xù)icrobiota-related代謝物(如膽汁酸,短鏈脂肪酸,芳香族氨基酸衍生品,支鏈氨基酸,等等)。因此，調節(jié)腸道菌群組成及其代謝功能具有抑制NAFLD發(fā)展的潛力。此前的研究表明，多酚具有類似益生元的作用，能夠改變腸道微生物平衡，改善腸道黏膜炎癥和通透性。因此，我們分析了不同區(qū)域的腸道菌群組成研究結果表明，CA可能參與調節(jié)腸道細菌組成。

? ? ? ? 研究了6組中回腸、盲腸、結腸3個腸段內容物中腸道菌群組成的變化。如圖5A所示，與ND組相比，HFD小鼠回腸腸道菌群中觀察到的OTUs明顯降低，同時盲腸和結腸的OTUs也有下降趨勢。添加0.16% CA的HFD組小鼠回腸和結腸OTUs顯著增加。有趣的是，在添加0.08% CA的ND組中，除了結腸OTUs的減少外，添加CA可導致正常飼糧小鼠OTUs的減少。進行Alpha多樣性分析，包括ACE(圖5B)、Chao1(圖5C)、Shannon(圖5D)和Simpson指數(圖5E)。ACE、Chao1、Shannon和Simpson的變化與OTUs的變化平行，表明HFD破壞了腸道菌群的豐富度和多樣性。同時，添加CA可在一定程度上恢復植物區(qū)系的豐富度和多樣性，尤其是在HFD中添加0.16% CA時。在ND組中添加CA導致了微生物群落豐富度和多樣性的降低，表明其作用可能與HFD組不同。此外，已知多酚可以下調微生物多樣性，顯著抑制致病菌的生長;因此，添加CA的ND組細菌OTU、豐富度和多樣性的降低可能與CA的抑菌作用有關。利用Beta多樣性分析分析腸道菌群整體結構的變化。主成分分析顯示不同的微生物群組成和單獨的集群之間HFD老鼠和ND老鼠,和HFD老鼠和HFD之間補充高濃度的CA。然而,HFD小鼠的腸道微生物群補充CA濃度較低的不是明顯不同于回腸HFD老鼠,盲腸和結腸。此外，ND處理組間的微生物菌群組成沒有差異(圖5F、G和H)。PCA識別出回腸、盲腸和結腸中兩個最易變的菌群——Allobaculum和Faecalibaculum，這意味著它們導致了組間觀察到的差異。PCA結果顯示，PC1(48.59%)具有a盲腸總方差高于PC2(21.36%)，說明CA處理可使hfd誘導的腸道菌群組成與ND組相似。通過beta多樣性分析，我們發(fā)現CA處理組(特別是添加0.16% CA)和HFD處理組具有不同的菌群組成，提示CA對腸道菌群的修飾作用。

圖5

6.腸道菌群與NAFLD相關參數的相關性

? ? ? ? CA對hfd誘導小鼠腸道菌群組成、體增重、內臟肥胖、血脂水平、炎癥等有保護作用。我們進一步采用Spearman秩相關法對上述過濾后的糞便細菌與NAFLD相關參數進行相關性分析。我們觀察到肝臟重量、體重、肝臟/體重、血清TC、HDL-C、LDL-C、LPS、TNF-a和IL- 6水平與Allobacul^n、Barne- siella、Faecalibacterium和uncultured_bact:erium_f_Muribaculaceae的相對豐度(屬水平)呈顯著負相關。此外,相對豐度(在屬級)的彎曲桿菌,Faecalibaculum,梭菌屬,Lachnospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5呈正相關,與上面的非酒精性脂肪肝相關參數,其中彎曲桿菌,Lach nospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5顯示最重要的正相關與非酒精性脂肪肝相關參數(圖6)。與這一結果一致,Allobaculum, Barnesiella,與ND組相比，高脂喂養(yǎng)小鼠的糞桿菌和未培養(yǎng)的細菌^Muribaculaceae減少。同時，HFD組Campylobacter、Faecalibaculum、Fusobacterium、Lachno- spiraceae_XPB1014_group和uncultured_bact:erium_f_p-251-o5的相對豐度增加，CA處理顯著降低了上述腸道菌群的相對豐度。

? ? ? ? ?

圖6

以上結果表明，HFD組的脂多糖抑制屬明顯減少。同時，HFD組的脂多糖產生屬增加，ca處理HFD組的脂多糖產生屬減少。例如，Allobaculum, Barnesiella和Faecalibacterium被報道為短鏈脂肪酸產生菌。短鏈脂肪酸可能刺激上皮細胞增殖，并在改善腸道屏障完整性方面發(fā)揮重要作用，可能抑制LPS釋放和抗肥胖活性。彎曲桿菌是一種影響宿主健康的機會致病菌。大腸桿菌志賀氏菌(escherichia -志賀氏菌)是一種革蘭氏陰性菌，其細胞壁中含有LPS，在HFD組中顯著增加。眾所周知，當腸道屏障受損時，革蘭氏陰性菌釋放LPS到血液中，它們與小腸細菌過度生長密切相關。糞鈣桿菌(Faecalibaculum)和梭桿菌(Fusobacterium)均為促炎菌，可能破壞腸道屏障，并與惡化的肝臟脂肪變性有關。它們也可能有助于NAFLD患者血清LPS和TNF-a的高表達。因此，我們得出結論，CA有助于平衡腸道脂多糖相關菌群失調，并有助于預防NAFLD中低級別慢性炎癥。

在這項研究中,我們表明,補充低和高濃度的CA HFD不僅減少HFD-induced肥胖、改善血清脂質,ALT, AST,葡萄糖,hsCRP,有限合伙人,TNF-a和il – 6和鈍化脂肪生成,而且還改變了在非酒精性脂肪肝小鼠腸道微生物群組成,表明CA除了可以作為新策略來抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)展。在大多數情況下，HFD中添加0.16% CA比低濃度CA更能有效地降低NAFLD相關參數。這些結果提示，腸道微生物群可能參與了CA對脂質代謝和NAFLD的影響。

7.結論

? ? ? ? 本研究采用高脂飲食誘導的C57BL/6J小鼠NAFLD模型，首次證實了CA對NAFLD小鼠腸道菌群的影響。我們報道CA顯著改變了腸道微生物的群落組成結構，并降低了NAFLD參數。此外，我們還發(fā)現一些微生物群的相對豐度與NAFLD參數密切相關。我們的研究結果表明，CA通過抑制腸道失調、促炎癥LPS釋放和隨后的脂質合成等綜合反應，對高脂飲食誘導的NAFLD發(fā)展發(fā)揮保護作用。

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