2 打開更新結題報告選項卡：進入參數更改設置

3 進行參數更改設置

4 參數全部填寫完成后，點擊提交

5 查看報告

6 新報告結果下載：打開新的報告，點擊這份報告的右上角-項目結果下載-進行下載結果數據，就可以得到更新的這份報告的全部結果。

注： 任務不要重復多次提交，一次建議只運行一個主流程任務，多任務并行會導致卡頓，以至運行失敗。一般正常任務 一天之內能夠分析完成，如一天之后還沒運行完成，可能就是任務失敗了，需要聯系后臺人員查看報錯原因處理。

• 以下只適用于云交付的項目，線下交付的項目不適用
• 微生物多樣性原始數據和分析結果報告均由平臺交付
• 微生物宏基因組報告和分析結果在平臺交付，原始數據由運營硬盤/網盤交付
• 微生物基因組報告和分析結果在平臺交付，原始數據由運營硬盤/網盤交付
• 百邁客云登錄鏈接：https://international.biocloud.net/zh/user/login
• 推薦使用谷歌/火狐瀏覽器進行操作，這兩個瀏覽器兼容性更高。

報告查找

進入項目管理 – 我的項目 – 打開對應的項目

結果下載

上述報告查找頁面 – 打開報告之后 – 點擊報告右上角 – 項目結果下載 – 選擇下載結果數據

結果數據較小的直接使用瀏覽器下載，較大的需要使用 ftp 下載，具體的 ftp下載指導在后續詳細介紹。

我們對于不同的產品對應了不同的編號加以區分，詳細如下：

報告/任務編號對應產品類型：

微生物多樣性：microbial_年月日編號

微生物多樣性更新報告：Microbial_updateReport_年月日編號

無宿主宏基因組：MetaG_年月日編號

有宿主宏基因組：MetaG_宿主拉丁名_年月日編號

宏基因組更新報告：metag_updateReport_年月日編號

微生物基因組：MicroG_年月日編號數據下載：上述報告查找頁面 – 點擊左側數據 – 進入相應數據文件夾

進入 microbial_*（或者其他產品類型對應的編號）對應的文件夾下 – 打開Needed_Data 文件夾，具體需要下載的文件如下：

打開原始數據文件夾

目前平臺不支持文件夾下載，所以需要打開相應文件夾，全選數據后進行打包下載。

FTP 下載指導：下載方式選擇 FTP 下載，平臺會將具體的操作步驟發到注冊郵箱賬號中，也會發到個人中心信息中，如下：

打開 FTP 客戶端：依次填寫好上述主機，用戶名，密碼，端口信息，打開之后選擇最新的文件夾，里面就是剛剛選中打包下載的數據，然后直接選中數據，拖拽到左邊目標文件夾中即可。

建庫測序分析產品以結題報告的形式交給老師，報告中的分組以老師提供的分析方案為準。老師們在拿到結果后，可能會有更改樣本名、重新分組、變更聚類參數、與其他同類型項目合并分析等需求。其中，更改樣本名、重新分組、過濾物種或抽平可以通過更新結題報告實現（見更新結題報告操作指導），而改變質控參數、添加更多樣本則需要重新投遞主流程（見 APP 主流程投遞操作指導）。

由于原始數據為線下交付，不再自動備份至云平臺，因此投遞主流程需要老師先將原始數據上傳至云平臺。本指導即為針對此需求撰寫的云平臺操作指南。

另：主流程分析權限（標準套餐）每項目一年售后期內可以免費開通 3 次，一次 10天，在權限時間內沒有分析次數限制，但是一次只能投遞一個任務。

上傳

1、登陸賬號后，在主頁面查看項目管理，進入“我的數據”

2、在我的數據中，建議新建文件夾后，進入新文件夾，點擊“上傳”，選擇上傳文件或 FTP 上傳。

上傳文件：選 擇 文 件 上 傳 ， 點 擊 “ 上 傳 ” ， 選 擇 下 載 好 的 原 始 數 據（\Needed_Data\Rawdata\01.Rawdata 路徑下的所有文件），點擊確定即可等待數據上傳完成。

網頁只能上傳 200MB 以下的數據，上傳更大的數據請點擊”FTP 上傳”。注：不支持上傳 0 字節文件！文件名不能包含中文及特殊字符！

FTP 上傳：數據量大于 200M 時使用 FTP 上傳數據。選擇“FTP 上傳”后彈出提示對話框，點擊“確定”后系統會自動創建一次性的 FTP 賬戶，用于本次數據上傳。賬戶信息會發送至注冊郵箱及平臺的“個人中心——消息中心”中。依照提示操作即可。

注：數據上傳完成后需要通過中轉站中轉，不會立刻顯示在平臺中。具體時間視數據量而定，最久約半天時間，若仍找不到數據請聯系售后人員處理。

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導致反復核對，影響樣本質量、錄入周期，導致提取核酸質量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等

1.2提取風險提示

核酸提取質量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環境等因素息息相關，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現的物種，請單獨溝通。送樣量結果展示為滿足提取一次的量，如樣品經過特殊處理或樣本狀態異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量

2.1常規植物組織送樣要求

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關檢測結果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當的純化方法，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務必確認您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續實驗的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質、顏色等物質導致會產生大量損失的風險，為保證樣本一次檢測合格并節約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標準的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣

4、樣品制備保存指南

4.1常規植物類樣本（不含藻類）制備流程

由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類組織中的水分會影響提取得率，取樣時需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環境24-48小時后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：

1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織（注：如果是需要進行處理，請在活體上進行處理后再取樣

2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準備好的凍存管中

3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標記編號、液氮預冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據組織樣本量選擇核酸凍存管

4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標記編號、液氮預冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據組織樣本量選擇核酸凍存管

5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉移至-80 °C長期保存（禁止亂放，尤其是項目中樣品個數較多時），干冰運輸

注：植物組織不建議使用組織保護液保存。對于一些需要剝去種皮處理的，因樣品速凍后無法準確剔除，如有需要剝去種皮的老師須自行操作

4.2Ultra Long ONT類植物樣本

4.2.1植物組織選取及取樣步驟

1)準備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長出的幼嫩根尖）

2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈

3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質和其他殘余碎片

4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去

5)將葉片稱量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標注樣本名稱，日期，準確重量

6)放入液氮快速冷凍 10min，轉入-80 °C 冰箱保存，干冰運輸

7)葉片剪下后的稱量等操作，請在 10min 內完成，時間過長會導致葉片失水不可用，部分地區氣溫較高失水更快，操作時間需更短

4.2.2注意事項與說明

1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟

2)林木 、灌木類的請根據生長周期來確定采樣時間， 最好是發芽后長出來的嫩葉

3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專門的黃化經驗，黃化太過會造成細胞核難提取 。如果不會黃化就送 1-2 周剛長出來的葉片，具體生長時間需根據植物的生長狀態判斷

4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請客戶多準備備份樣本

5)送樣前請拍照記錄樣品狀態

5、注意事項

核酸提取質量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態、提取方法及操作、實驗器材及環境等因素均有密不可分的聯系，尤其是三代超長提取對樣本的質量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質量的核酸，請務必按照送樣手冊所規定的準備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時間：組織離體后，胞內核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內完成，越快越好。速凍時間過短會導致速凍不徹底，核酸有降解風險

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內核酸量較低，需適當增加送樣量，比如動物皮膚、毛發等。請嚴格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險

3)組織狀態：不建議送組織狀態差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態， 確保組織未發生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質量會造成不同程度的影響，常見的會導致核酸 的降解或者得率降低。因此，經過特殊處理的樣本，在送樣時，務必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費

6、不合格樣品存在風險

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

6.2降解樣本風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

5)導致數據duplication比例高、隨機性差

6)導致Small RNA rRNA比例高，影響有效數據，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準，影響問題質量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導致文庫隨機性差等問題

3)文庫構建失敗

4)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

6.4目標RNA含量低

1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導致建庫失敗

2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導致建庫失敗或者測序數據中rRNA 數據比例高

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導致反復核對，影響樣本質量、錄入周期，導致提取核酸質量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等

1.2提取風險提示

核酸提取質量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環境等因素息息相關，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注1：未在表格出現的物種，請單獨溝通。送樣量結果展示為滿足提取一次的量，如樣品經過特殊處理或樣本狀態異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量

注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質，細胞密度低，核酸含量較少；毛發暴露在外界環境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細胞多難獲取，為了保證您實驗的順利進行，這兩個部位不建議送組織樣，建議自行提取

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關檢測結果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當的純化方法，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務必確認您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續實驗的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質、顏色等物質導致會產生大量損失的風險，為保證樣本一次檢測合格并節約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標準的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣。

4、樣品制備保存指南

4.1常規動物類樣本

送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優先級：血液>內臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細胞的病變組織），立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產品適用）

1)提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并在做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大小）

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標注編號

6)立即（20s內）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉移至-80 °C長期保存

7)干冰運輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細胞和研磨后的組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務必先進行液氮研磨破碎，樣品量取參考標準送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉至新的2.0ml離心管中（拍質控照片，方便核查），轉移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉移至-20 °C 或-80 °C 長期保存

3)RNAlater? Solution 不會影響組織結構，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存

注：如果組織較小，建議優先選擇此方式送樣

4.2全血

DNA類產品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產品優先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關產品僅接收全血或分離的細胞樣本，不接收血清、血漿。

4.2.1DNA常規產品制備操作流程

1)用醫用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉移至EP管中，玻璃材質采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標記（樣本名稱，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運輸需避開節假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運輸至實驗人員手中不可超過 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據實際情況送樣）

3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據實際情況送樣）

4)做好標記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細胞內 RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰是細胞內 RNA不穩定，在采血后幾小時內迅速降解。 此外，通過基因誘導過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導均會導致體內基因轉錄物相對數量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導，可穩定體內基因轉錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現準確的基因轉錄物檢測和定量

2)采集前準備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩定劑）

B.符合標準的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護裝備（手套、護目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標本識別標簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應當先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機構推薦的標準靜脈穿刺技術程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內所采集標本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細信息

4)注意事項

A.確保采血管在有效期內，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預先打開管蓋，避免穩定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運輸期間破裂的風險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運輸協議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導致分析結果錯誤或產品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

4.3細胞

4.3.1貼壁細胞

4.3.1.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態良好；離心得到細胞沉淀（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.3.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

注：判斷裂解液加入量是否合適的標準可以根據細胞溶解物的黏度來判斷。在細胞剛溶解時，可以發現有絲狀物出現，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應繼續補加裂解液。裂解液加入量過少，會導致抽提的 RNA 降解

4.3.2懸浮細胞

4.3.2.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態良好；離心得到細胞沉淀（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.3.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

5、注意事項

核酸提取質量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態、提取方法及操作、實驗器材及環境等因素均有密不可分的聯系，尤其是三代超長提取對樣本的質量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質量的核酸，請務必按照送樣手冊所規定的準備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時間：組織離體后，胞內核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內完成，越快越好。速凍時間過短會導致速凍不徹底，核酸有降解風險

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內核酸量較低，需適當增加送樣量，比如動物皮膚、毛發等。請嚴格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險

3)組織狀態：不建議送組織狀態差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態， 確保組織未發生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質量會造成不同程度的影響，常見的會導致核酸 的降解或者得率降低。因此，經過特殊處理的樣本，在送樣時，務必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費

6、不合格樣品存在風險

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

6.2降解樣本風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

5)導致數據duplication比例高、隨機性差

6)導致Small RNA rRNA比例高，影響有效數據，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準，影響問題質量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導致文庫隨機性差等問題

3)文庫構建失敗

4)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

6.4目標RNA含量低

1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導致建庫失敗

2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導致建庫失敗或者測序數據中rRNA 數據比例高

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導致反復核對，影響樣本質量、錄入周期，導致提取核酸質量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等

1.2聲明

對于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運營與醫學實驗平臺負責人溝通，確認無高致病和傳染性且能進行后續實驗后再安排樣品寄送。危害程度的判定標準具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》

1.3提取風險提示

核酸提取質量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環境等因素息息相關，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現的物種，請單獨溝通。送樣量結果展示為滿足提取一次的量，如樣品經過特殊處理或樣本狀態異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量

2.1常規動物類組織送樣要求

2.2動物類血液送樣量

2.3動物類細胞送樣量

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關檢測結果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當的純化方法，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務必確認您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續實驗的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質、顏色等物質導致會產生大量損失的風險，為保證樣本一次檢測合格并節約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標準的，請在核酸量足夠的前提下盡量按

4、樣品制備保存指南

4.1常規動物類樣本（脊柱動物、哺乳動物）

常規動物主要包括脊椎動物組織樣本主要包括：哺乳動物、禽類、爬行動物以及兩棲動物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優先級：血液>內臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細胞的病變組織），立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產品適用）

1)提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并在做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大小）

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標注編號

6)立即（20s內）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉移至-80 °C長期保存

7)干冰運輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細胞組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務必先進行液氮研磨破碎，樣品量取參考標準送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉至新的2.0ml離心管中（拍質控照片，方便核查），轉移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉移至-20 °C 或-80 °C 長期保存

3)RNAlater? Solution 不會影響組織結構，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存

4.2全血

DNA類產品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產品優先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關產品僅接收全血或分離的細胞樣本，不接收血清、血漿

4.2.1DNA常規產品制備操作流程

1)用醫用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉移至EP管中，玻璃材質采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標記（樣本名稱，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運輸需避開節假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運輸至實驗人員手中不可超過 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據實際情況送樣）

3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據實際情況送樣）

4)做好標記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細胞內 RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰是細胞內 RNA不穩定，在采血后幾小時內迅速降解。 此外，通過基因誘導過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導均會導致體內基因轉錄物相對數量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導，可穩定體內基因轉錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現準確的基因轉錄物檢測和定量

2)采集前準備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩定劑）

B.符合標準的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護裝備（手套、護目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標本識別標簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應當先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機構推薦的標準靜脈穿刺技術程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內所采集標本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細信息

4)注意事項

A.確保采血管在有效期內，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預先打開管蓋，避免穩定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運輸期間破裂的風險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運輸協議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導致分析結果錯誤或產品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

4.3昆蟲

1)昆蟲樣本，需進行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲，例如蚊子，血吸蟲，該類型樣本可能存在外源污染，需要進行切腹，去除腸道處理。較大個體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大小），對于較小個體只能用整個個體的，應進行適當的饑餓處理（注意保證昆蟲的活性）

2)提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內）

3)轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

注1：小型昆蟲組織務必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時該類樣本因只滿足一次或低于常規一次提取用量，我們無法保證100%提取合格

注2：蜜蜂送樣時盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個蜜蜂送樣提取的核酸狀態大多數異常，影響后續實驗。不建議送實驗室剔除，因為組織速凍過之后再剔除會化凍，提取降解的可能性較大

4.4微生物

4.4.1細菌

1)顯微鏡下觀察細菌生長狀態，建議收集生長期處于對數期的細菌

2)將適量體積的菌液轉移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min

3)棄掉培養基，將細菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉移至-80 °C長期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

5)以下為不規范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）

4.4.2真菌

4.4.2.1單細胞真菌

單細胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應所需酵母菌的量需≤1×107個，以 5×106-1× 107個為宜。您要做的項目要求送樣量較大時，可以將樣品按上述數量要求分裝后單獨保存

1)顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態，最好收集生長期處于對數期的酵母菌

2)將適量體積的酵母菌液轉移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min

3)棄盡培養基，將酵母細胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉移至-80 °C長期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

4.4.2.2多細胞真菌（大型真菌）

1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標記（樣本名稱，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送

2)菌絲：將無菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細菌來源。然后，將棉簽迅速劃過培養基表面，以收集菌絲轉移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）

4.5水產類

水產類包括淡水魚類、海水魚類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本

1)優先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時應選取核酸含量較多的部位

2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體

3)活體取材后用預冷的0.9%生理鹽水進行清洗，去除血漬和污物

4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大小），樣品分割和處理時應盡量在冰上進行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染

注：水產類樣品需盡量保證為新鮮個體。盡量避免寄送保存時間較長或經過反復凍融的組織樣品。針對軟體動物可先使用75%的乙醇進行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運輸；針對刺胞動物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取

4.6細胞

4.6.1貼壁細胞

4.6.1.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態良好；離心得到細胞沉淀（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.2懸浮細胞

4.6.2.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態良好；離心得到細胞沉淀（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

5、注意事項

核酸提取質量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態、提取方法及操作、實驗器材及環境等因素均有密不可分的聯系，尤其是三代超長提取對樣本的質量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質量的核酸，請務必按照送樣手冊所規定的準備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1)組織速凍時間：組織離體后，胞內核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內完成，越快越好。速凍時間過短會導致速凍不徹底，核酸有降解風險

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內核酸量較低，需適當增加送樣量，比如動物皮膚、毛發等。請嚴格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險

3)組織狀態：不建議送組織狀態差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態， 確保組織未發生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質量會造成不同程度的影響，常見的會導致核酸 的降解或者得率降低。因此，經過特殊處理的樣本，在送樣時，務必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費

6、不合格樣品存在風險

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

6.2降解樣本風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

5)導致數據duplication比例高、隨機性差

6)導致Small RNA rRNA比例高，影響有效數據，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準，影響問題質量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導致文庫隨機性差等問題

3)文庫構建失敗

4)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

6.4目標RNA含量低

1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導致建庫失敗

2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導致建庫失敗或者測序數據中rRNA 數據比例高

一、百邁客Hi-C取樣要求

1、基本要求

1.1安全

1)人身安全：現有實驗條件下（采取一定防護后），樣品對實驗人員本身無傷害

2)環境安全：樣品對室內、室外環境無影響（以免因為不小心導致一些活體樣本進入外界 環境造成不良影響）

1.2無污染

1)植物樣本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有蟲害（尤其是一些肉眼不容易發 現的蟲卵等）

2)全血樣品不得引入取血物種本身攜帶的病菌、病毒等潛在污染

1.3依據“理論”&“實踐”

1)“理論”：基于各種實驗原理的理論依據

2)“實踐”：基于 BMK 本身積累的多物種、多樣品的項目經驗

1.4送樣說明

1)客戶或銷售人員應將樣本的信息詳細說明，所有樣品必須標注好關鍵樣品信息：如物種名 稱、樣品名稱、到樣日期、是否需要返樣等

2)樣品信息單必須早于或與樣品同時到達公司，一則方便樣品中心錄樣，二則方便項目盡快 啟動

3)因為樣品首次取樣不足、質量不好或信息單未及時到位造成項目進度延后時需要由客戶或 銷售部承擔相關責任（特殊項目除外）

4)因公司內部培養條件不能同時滿足各種物種的生長需求，因此，送達活體樣品應該盡量是 送到即可進行實驗的樣品（量足，質好），不建議在公司保存過長時間，防止培養樣本死亡

5)所有需要特殊關注的樣品，在華開任務單中需要備注相關信息，并提前郵件通知 Hi-C 相關 注意事項；特殊物種需要書面告知材料培養條件（光、溫度、水、肥 or 有機營養物等等）

6)生長狀態趨于不好的樣品，或一些離體枝條需要提前與實驗溝通，保證到樣后可及時處理 樣品

1.5法定節假日期間和周末送樣要求

1)節假日當天及假日前后各一周不建議再到樣， 如遇特殊情況需要節前一周與實驗平臺溝通送樣需求

2)周末休息日2 天不建議到樣，如遇特殊情況需要節前一周與實驗平臺溝通送樣需求

2、動物樣本-全血

2.1新鮮血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后立即送樣，并盡量確 保 24h 內運至實驗室

2.2凍存血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后直接液氮速凍，干冰 運輸

2.3血液需求量

每一個樣品，建議送樣 1~2 mL

2.4全血取樣注意事項（防止污染、溶血）

1)取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液 樣品被物種本身攜帶的細菌等污染物污染

2)準備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規格）

3)依據抗凝管的實際規格采取全血樣品，比如：10mL 規格的抗凝管可以取樣 10mL

4) 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

5)天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運輸時使用冰袋低溫運輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運輸時無需加冰袋 運輸

3、動物樣本-組織標本

3.1凍存樣品取樣要求

1)應保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

2)應將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈

3)直接液氮速凍干冰運輸

3.2凍存組織樣品理論用量

組織量 2 g 為佳，最少 1 g；1 g 可滿足 3 個文庫構建，最低要求至少 0.2 g

4、動物樣本-細胞

4.1取樣要求

需要進行甲醛交聯固定后送樣

4.2細胞樣品量要求

一般來講 2*10^6個細胞滿足一個 Hi-C 文庫，建議培養到 107 個細胞用于固定，以保證 試驗的可重復性， 由于細胞的數量可能會影響 Hi-C 試驗的質量，因此需要細胞數目盡量精確

4.3交聯細胞

1) 取 10^7 個新鮮活細胞置于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 的 cold 1×PBS 搖勻，1000 g， 4℃離心 2 min

2)吸棄上清，每管再次加入 10 mL 的 cold 1×PBS 輕混勻，1000g ，4℃離心 2 min

3)吸棄上清，用 10 mL cold 1 × PBS 重懸沉淀，加入適量（570 μL）37%甲醛（終濃度 2%）混勻，室溫放置 10 min(1-2 min 混勻一次)；（注意甲醛需要使用 sigma 等進口品 牌，以免影響固定效果，也可以由當地銷售申請實驗室寄送固定試劑）

4)加適量（710 μL）2 M 的甘氨酸（常溫保存）終止反應（終濃度 0.125 M），室溫混勻5min，冰上放置15min

5)固定好的細胞 600 g 4℃ 離心 8 min ，棄上清

6)1 mL cold PBS 重懸沉淀，600g 4℃ 離心 8 min ，去上清

7)液氮速凍干冰運輸或-80℃保存

注：做到此步直接液氮速凍，干冰運輸，信息單中備注：“細胞交聯完成”

5、真菌樣本

5.1凍存樣品—“慢凍快融”或“直接速凍 ”

1) 應保證菌體為對數生長期，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

2)直接液氮速凍干冰運輸

5.2組織樣品理論用量

組織量 1 g 為佳，最少 0.2 g

6、植物樣本

6.1活體植株

1)幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗、組培苗——全部葉片、部分幼嫩莖

2)成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片

3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1g

4)其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件，以保證樣品的正常生長

6.2離體枝條

1)枝條選擇：枝條頂端有待萌發葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉（到樣后會選擇葉片進行實驗）；枝條中下端保留部分成熟葉片

2)枝條預處理：剪斷枝條， 自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋， 袋中 噴水，填充部分空氣，密封袋口

3)枝條運輸： 自封袋放入泡沫箱，箱體內側壁放部分冰袋（保證低溫運輸），冰袋與自封袋 間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導致樣品被凍傷

4)運輸時間：保證 24h內到樣，最多不得超過 3天

5)取樣量：保證每一個庫的理論用量1g

6)其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過大等導致的取樣或運輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實驗；離體枝條如果保存、運輸不善會存在部分潛在風險：即得到的實驗效果可能會比活體植株檢測結果 稍差（理論上的潛在風險）

6.3凍存植物組織

6.3.1凍存組織風險

1)植物組織液氮速凍后容易造成破碎，導致后續固定等操作無法有效實施

2)植物組織破碎嚴重時會對核甚至染色體造成物理機械損傷

6.3.2取樣要求

1)從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于 2mL或更大體積的旋蓋凍存管中，每份植物> 1 g，準確標記樣品名稱

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，植物> 1 g/份，以防部分樣品降解重新取材、制備或送樣

6)應保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

7)運送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進行運輸

6.4其他植物樣本

1)非葉片（活體植株）：有常規提取經驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

2)非葉片（離體植株）：處理與運輸與離體枝條相同，有常規提取經驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1 g

4)非葉片樣品適用于葉片難提取的植株或老師的特殊要求，此類樣品DNA提取失敗的風險高于葉片樣本，需要銷售與老師交代清楚

6.5植物取樣注意事項

1)建議一次送樣量在 1~4g

2)所有待取的幼嫩組織長勢必須正常（無病蟲害、無營養缺失）

3)對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉

4)因為通常裸子植物比被子植物更難選擇適合的解離液，裸子植物的葉子大多為針形、 線形、鱗形，葉片表面有較厚的角質層，細胞內次生代謝物多，這對提取完整的細胞核極為不利，因此，選取

萌發的新鮮幼苗作為材料會更合適

5)客戶沒有條件寄送活體植物樣本時，可以選擇自己固定，由當地銷售像實驗室申請寄送固定試劑 ( β-巰基乙醇需要老師自己準備）

7、Hi-C交聯流程

1)配制NIBuffer工作液 1 ，配制好后置于冰上放置

2)取2g新鮮幼嫩組織樣品，用冰水清洗干凈

3)用剪刀將樣品組織剪碎，放置于50mL 離心管中

4)加入上述配制好的NIBuffer 工作液1

5)加入 2 mL 36%甲醛溶液，室溫條件下，旋轉雜交爐中反應 90 min

6)加入2.5 mL 2M甘氨酸，連續手搖 5 min終止交聯反應

7)濾掉液體，用滅菌水清洗至無泡沫為止

8)吸干樣品表面水分，將樣品置于預冷的50ml離心管中，并將管置于液氮中

9)-80℃保存或干冰寄送

二、百邁客 ATAC-seq 取樣要求

1、生物學重復

取樣應盡量減少重復間樣品的差異。盡可能做到重復在取樣時間、部位、處理條件等方 面保持一致，不同樣本的性別、年齡盡量相同，否則可能會影響實驗結果的可重復性及可信度

每個處理至少3個生物學重復

2、樣品的保存與運輸

簡單處理并標記后，應立即浸入液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱，以免實驗操作前 樣品降解的可能性

3、取樣要求

3.1組織樣本

1)獲取組織樣本

A.動物：取下新鮮的組織，立即剔除結締組織和脂肪等雜質部分，用預冷的 1×PBS 溶液漂洗，將組織表面的殘留血液沖洗干凈

B.植物：從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中 ，每份組 織>50mg ，準確標記樣品名稱

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，組織>50mg/份，以防部分樣品降解重新取材、 制備或送樣

6)運送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進行運輸

7)注意事項

A.昆蟲類樣本建議進行饑餓處理后送樣

B.若樣本有微生物污染（細菌、病毒等），實驗過程無法去除，下機數據會有污染

3.2細胞樣本

3.2.1貼壁細胞

3.2.2懸浮細胞

1)細胞獲取

A.將貼壁細胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細胞懸液

B.確定細胞生長狀態良好

2)按照 50萬個細胞每管進行分裝，準確標記后將分裝好的細胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們再挑選 5萬個相對完整的細胞核進行實驗）

3)小心吸去全部上清，加入 500 μL 預冷的 1×PBS 溶液洗滌，4℃ 、500G 離心 5min

4)小心吸去全部液體，加入 1 mL 預冷的細胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細胞沉淀混勻， 管壁標記樣本名稱，慢速梯度降溫凍存

5)梯度降溫可參考：4 度 10min＞負 20 度 30min＞負 80 度過夜＞液氮凍存

6)將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰 進行運輸

7)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，50萬個/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣

注：若細胞樣本有支原體污染，實驗過程無法去除，下機數據會有污染

3.3全血樣本

1)新鮮血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝 素鈉抗凝會影響后續實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，確保

5天內運至實驗室

2)凍存血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，平衡

2 h 后直接液氮速凍，干冰運輸

3)注意事項

A.取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細菌等污染物污染

B.準備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規格）

C.依據抗凝管的實際規格采取全血樣品，比如：10mL規格的抗凝管可以取樣 10mL

D.取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

E.天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運輸時使用冰袋低溫運輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運輸時無需加冰袋運輸